Fatores de virulência de A. actinomycetemcomitans: participação na doença, regulação da expressão, diversidade e resposta imune

Resumo

Actinobacillus actinomycetemcomitans é associado principalmente a periodontite agressiva na forma localizada (pJL) e a algumas formas de periodontite Ccônica. Existe diversidade entre as cepas da espécie, que pode se refletir na virulência do organismo. A análise por ISs é uma técnica promissora para diferenciar a bactéria, pois os padrões de hibridização de elementos móveis como a IS 150-like apresentam grande diversidade, sendo o método indicado para pequenos estudos epidemiológicos de subpopulações particulares de A. actinomycetemcomitans. Por outro lado, a análise com uma IS mais estável permitiria a análise filogenética. A análise de fragmentos de restrição por eletroforese em campo elétrico pulsátil (pFGE) é considerada o padrão ouro para análise da estrutura filogenética de populações. No presente estudo nos propomos determinar a estrutura filogenética por PFGE de uma coleção de cepas de A. actinomycetemcomitans isoladas em diferentes regiões, inclusive no Brasil, de indivíduos com diferentes condições periodontais, e determinar a relação entre as subpopulações de cada região através de ISs. Além disso, essa diversidade será comparada a variabilidade em uma série de genes associados à virulência e ao fenótipo da cepa. A Toxina Distensora Citoletal (CDT) codificada pelo operon cdt em A. actinomycetemcomitans (Mayer et ai, 1999) é a única toxina bacteriana conhecida capaz de induzir um dano imediato no DNA das células alvo. Em estudo prévio, demonstramos que os títulos tóxicos variam entre as amostras (Fabris et al, 2002) Além disso, uma deleção presente no promotor do operon ltx, aumenta a expressão da leutcotoxina, e estas cepas estão fortemente associadas a PJL (Bueno et al, 1998) principalmente em indivíduos de origem africana. As amostras serão caracterizadas quanto à estrutura do promotor do operon ltx e cdt, e quanto ao polimorfismo dos genes aae e apaH, relacionados com a aderência a células epiteliais e invasão, respectivamente. A resposta imune e a produção de CDT in vivo não são conhecidas, por isso pretendemos purificar as três proteínas formadoras do complexo CDT (CDTA, CDTB e CDTC) e determinar a resposta imune humoral contra estas proteínas, utilizando soros de pacientes com diferentes condições periodontais. Recentemente pudemos observar que o extrato bruto de E. coli recombinante expressando AaCDT foi capaz de inibir a síntese de NO por macrófagos peritoneais (FERNANDES, 2002). Para confirmar esta observação, será avaliado o efeito do complexo CDT e das proteínas que o compõe sobre a produção de NO, distensão celular e análise do ciclo celular em células eucarióticas. Actinobacillus actinomycetemcomitans apresenta diversas proteínas de superfície (omps), com papel na virulência do organismo. Os títulos de anticorpos contra as proteínas de superficie OMP29, OMPIOO e Aae serão analisados no soro de pacientes com diferentes condições periodontais. Os títulos de anticorpos contra OMP29 e OMP 100 foram associados com a infecção pelo organismo. Recentemente foi descrita em Actinobacillus actinomycetemcomitans a proteína de superfície Aae, responsável pela adesão da bactéria acélulas epiteliais. Aae é homóloga a proteína Hap de Haemophilus influenzae, mas algumas de suas propriedades não forma ainda analisadas em Aae, como imunogenicidade ou a adesão a componentes da matriz extracelular como colágeno e fibronectina. Ainda não foram demonstradas em Aae de A. actmomycetemcomitans. O gene aGe., que codifica a proteína Aae apresenta variação principalmente no número de repetições entre as amostras, que possivelmente interfere na suscetibilidade à inibição pela lactoferrina no processo de adesão bacteriana e na capacidade de adesão e invasão da bactéria. Será obtida uma amostra mutante deficiente na produção de Aae, e serão comparadas as capacidades de aderência a proteínas da matriz extracelular, de adesão a hidroxiapatita recoberta por saliva (SHA) da amostra mutante e selvagem. A regulação de genes associados à virulência em A. actinomycetemcomitans é pouco entendida. Nos propomos a obter uma amostra de mutante no gene orcB, que codifica uma proteína sensora do potencial de oxirredução e sinaliza para uma OMPR-like (arcA) que regula a transcrição. Já foi demonstrado que o operon ltx é regulado pelo sistema quorum sensing da bactéria e possivelmente pelo sistema Arc. As amostras mutante e selvagem de A. actinomycetemcomitans serão submetidas a diferentes condições de cultura para verificar a expressão de diferentes fatores relacionados a hidrofobicidade, capacidade de aderência em células epiteliais, produção de toxinas como a toxina distensora citoletal e a leucotoxina. A transcrição de diferentes genes será avaliada através de RT-PCR e de RAP-PCR entre as cepas mutante e selvagem, e determinados os genes expressos de maneira diferencial. (AU)