Avaliação do papel dos receptores TLR2 e TLR4 na produção de citocinas por fibroblastos humanos periodontais deficientes desses receptores

Resumo

Fibroblastos periodontais são células capazes de responder à estímulos bacterianos com a liberação de substâncias, tais como citocinas e quimiocinas, que participam de maneira ativa no processo inflamatório. Há evidências do reconhecimento desses estímulos pela participação de receptores do tipo Toll (TLRs), sendo o TLR2 e TLR4 bastante estudados como responsáveis por esse mecanismo nos fibroblastos de ligamento periodontal e de gengiva. No entanto, essa expressão de receptores pelos fibroblastos periodontais permanece controversa na literatura e ainda não há estudos que avaliem o comportamento dessas células, quando deficientes desses receptores, quanto à expressão de citocinas como MIP-1±, SDF-1, IL-6 e IL-10. Assim sendo, este trabalho tem como objetivos: avaliar e comparar a expressão de receptores TLR2 e TLR4 por fibroblastos humanos provenientes de ligamento periodontal e de gengiva estimulados por lipopolissacarídeo (LPS) de P. gingivalis e avaliar a produção de citocinas em fibroblastos deficientes desses receptores. Serão coletados ligamentos periodontais de terceiros molares hígidos e biópsias de gengiva dos mesmos doadores (n=3). Estes tecidos serão picotados e mantidos em meio de cultura adequado para fibroblastos, sendo utilizados entre a 4ª e 8ª passagem. Após adesão dos fibroblastos a placas de 24 poços, o meio de cultura contendo 0,1 - 10 ¼g/mL de LPS de P. gingivalis será adicionado às placas em duplicata. A expressão de TLR2 e TLR4 será analisada por western blot nas células estimuladas em comparação às células não submetidas ao estímulo (controle). Será feito o silenciamento dos genes de TLR2 e TLR4 por meio da utilização de RNAi, seguido de testes que avaliem a eficiência da transfecção das culturas como RealTimePCR e Western Blot . Para avaliar a produção de citocinas pelos fibroblastos deficientes de TLR2 e TLR4, será feito ELISA. (AU)