Determinação dos sítios de clivagens de alvos de ADAM-17 recombinante em cultura de células humanas

Resumo

Os objetivos desse estudo serão buscar novos alvos para ADAM-17 e determinar os sítios de clivagens específicos dessa proteinase utilizando abordagens de Biologia Molecular e proteômica/espectrometria de massas. Para isso, as sequências de cDNA correspondentes aos domínios metaloproteinase, tipo-disintegrina e rico em cisteínas da ADAM-17 e tipo epidermal serão amplificadas pela reação em cadeia com polimerase e subclonadas nos vetores de expressão. Após expressão e purificação, a proteinase recombinante será incubada com cultura de células humanas não tumorigênicas (controle normal) e tumorigênicas, respectivamente HaCaT e SCC-9. As proteínas clivadas ou liberadas da superfície das células HaCaT e SCC-9 serão digeridas com tripsina e os sítios de clivagens serão identificados por espectrometria de massas. As estratégias utilizadas nesse estudo podem identificar novos alvos celulares e de matriz extracelular da ADAM-17 em células tumorigênicas e não tumorigênicas e elucidar os sítios de preferência de uma proteinase intrínsecos ao seu mecanismo de ação, como também é uma das estratégias para o desenho de substratos peptídicos e inibidores. (AU)