Estudo do perfil de N-glicosilação e dos sítios de ocupação em várias preparações de tireotropina humana (hTSH) hipofisária e recombinante

Resumo

A grande maioria das proteínas recombinantes de interesse farmacêutico é glicosilada e possui, portanto, um ou mais sítios de potencial glicosilação, nem sempre todos ocupados. A importância da fração de carboidrato de uma glicoproteína já é amplamente conhecida, estando diretamente ligada à solubilidade, estabilidade, enovelamento, assemblagem, meia vida circulatória, e atividade biológica in vivo. Somente recentemente, porém, está sendo considerada a importância da micro e macro-estrutura dos carboidratos, que se identificam especialmente com o perfil das glicoformas e suas variações (glycoprofiling) e com a ocupância, ou seja, a fração de sítios potenciais efetivamente glicosilados. Estes parâmetros, raramente determinados, estão diretamente relacionados com o tráfego intracelular, inflamação, mecanismos de defesa e também com várias doenças entre as quais as síndromes devidas a várias alterações congênitas da glicosilação (CDG). Por estas razões, considerando também a experiência adquirida pelo nosso grupo de pesquisa no estudo das glicoproteínas hormonais em geral e da prolactina e tireotrofina em particular, nos dedicamos à padronização de uma metodologia que permita a simultânea determinação destes dois parâmetros: perfil das glicoformas e porcentagem de ocupância. Isto pode ser realizado, ao nosso ver, com base na análise dos N-glicanos (N-glycoprofiling) e determinação da massa molecular da glicoproteína, ambas realizadas mediante MALDI-TOF. O presente projeto se propõe, portanto, de realizar estas determinações em 6 preparações de hTSH de origens diferentes, duas hipofisárias e quatro recombinantes, considerando que os resultados obtidos serão extremamente interessantes seja para a validação da metodologia em si que para o estudo das diferenças existentes entre o produto nativo, secretado pela hipófise humana, e os recombinantes derivados de células humanas HEK 293 ou de CHO. Ressaltamos que o produto derivado de células CHO é atualmente em uso como biofármaco para o diagnóstico e a terapia do câncer da tireóide. Será também realizada uma identificação relativa à ocupância e aos tipos de N-glicanos presentes em cada um dos três sítios de glicosilação em uma preparação hipofisária e duas recombinantes. Isto poderá abrir novas perspectivas relativas ao estudo destas estruturas. (AU)