RNAs não codificantes na doença renal diabética

Resumo

Introdução: A nefropatia diabetica (ND) é a maior causa de doença renal terminal no mundo e novas terapias são necessárias com urgência. Os estudos focados em novos mecanismos da patofisiologia da doença renal diabética, bem como o desenvolvimento de potenciais novas intervenções terapêuticas, que têm como alvo RNAs não codificantes e mecanismos epigenéticos, são muito importantes. Esta proposta se baseia em um recente trabalho do grupo do Dr. Advani, no qual foi demostrado que o aumento na expressão da histona metiltransferase EZH2 (do inglês enhancer of zeste homolog 2), pela inibição do micro RNA miR-101, diminui a expressão da proteína de interação com a tiorredoxina (TxnIP, um inibidor de sistema antioxidante endógeno) e atenua o estresse oxidativo, na ND. Objetivos: A hipótese principal é de que o miR-101 promove injúria renal no diabetes. Os dois objetivos principais são: 1) determinar o efeito da inibição do miR-101 na estrutura e função renal em ratos diabéticos e 2) examinar os mecanismos pelos quais a inibição do miR-101 previne a injúria induzida por alta glicose, em podócitos. Métodos: OBJETIVO 1: Ratos machos Sprague Dawley (idade de 8 semanas, n=12/grupo), serão randomicamente selecionados para receber injeção na veia caudal de estreptozotocina (50 mg/kg, em tampão citrato de sódio 0,1 mol/L) ou tampão apenas; 24 horas depois, os animais serão novamente randomizados para receber inibidor do miR-101 (LNA-anti-microRNA-101, 2mg/kg) ou controle, 2 vezes na semana, por injeções subcutâneas. Os ratos receberão também injeções de insulina (1-4 unidades, 3 vezes na semana). Parâmetros metabólicos (peso corporal, glicemia, HbA1c, pressão arterial sistólica) e renais (proteinúria, albuminúria, ritmo de filtração glomerular, excreção de 8-OHdG e creatinina plasmática) serão continuamente avaliados. Após 8 semanas os animais serão eutanasiados e parâmetros da estrutura renal serão avaliados: 1) expressão de miR-101 por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR); 2) expressão proteica da EZH2 por immunoblotting; 3) expressão gênica (qPCR) e proteica (immunoblotting) de TXNIP; 4) ultraestrutura e número de podócitos por microscopia de transmissão eletrônica (MTE); 5) expansão mesangial e espessamento da membrana basal por TEM e análise semiquantitativa em cortes renais corados com ácido periódico de Schiff. OBJETIVO 2: Podócitos diferenciados de camundongo serão depletados de EZH2 pela transfecção de um mutante dominante negativo (flag-tagged EZH2) por vetor retroviral ou farmacologicamente utilizando DZNep (5¼M). Serão avaliadas a expressão gênica e proteica de TxnIP e a geração de espécies reativas de oxigênio (pelo metódo de CFDA e citometria de fluxo). Tendo confirmado que o aumento da expressão de EZH2 está implicada na prevenção do estresse oxidativo, avaliaremos se a inibição do miR-101 resulta em aumento da associação de EZH2 com o promoter da TxnIP, através da exposição dos podócitos ao LNA-anti-microRNA-101, na presença ou ausência de alta glicose. A associação será confirmada por ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e a trimetilação da histona 3 na lisina 27 neste sítio será determinada através de anticorpo anti-H3K27me3. Para determinar se o aumento da tiorredoxina (Trx) é o responsável pela prevenção do estresse oxidativo, os podócitos terão a Trx inibida (transfecção com adenovirus shRNA para Trx), antes da leitura de CFDA. Para determinar se a inibição do miR-101 regula a geração de espécies reativas de oxigênio através da NADPH oxidase (NOX), avaliaremos a expressão gênica e proteica da NOX4 e a sua atividade (método da lucigenina).Importância geral do estudo: com este estudo buscamos a proposição de novos mecanismos acerca do papel desempenhado pelo miR-101 na ND, em um momento em que a inibição de microRNAs tem recebido progressiva atenção como nova abordagem terapêutica.