Avaliação da indução de instabilidade genômica e alterações metabólicas pela enzima scd1 em linhagens celulares de hepatócitos

Resumo

O carcinoma hepatocelular (HCC) é a sexta neoplasia mais frequente, sendo a terceira causa de morte atribuída por câncer. A fisiopatologia do HCC é um tema em evolução e parece ser multifatorial. Igualmente aos demais cânceres, o HCC surge a partir de mutações em determinados genes. Estudos recentes têm sugerido que a enzima SCD1 (estearoil-CoA desaturase 1) está associada a predisposição genética à hepatocarcinogênese em camundongos e ratos, enquanto que a supressão desta pode reduzir a proliferação em linhagens de células HCC, de forma dependente de Akt. Diversos estudos têm mostrado que a SCD1 está aumentada em muitos tipos de câncer e em diversas disfunções metabólicas, tais como diabetes, obesidade, esteatose hepática não-alcoólica e em outras doenças que predispõem ao surgimento do câncer. Entretanto, os mecanismos moleculares e o entendimento sobre a influência da SCD1 na instabilidade genômica que podem resultar no desenvolvimento do carcinoma hepatocelular permanecem desconhecidos. Dessa maneira, o presente projeto pretende avaliar o potencial da enzima SCD1 em promover instabilidade genômica e alterações metabólicas e morfológicas que levam à transformação tumoral em células hepáticas não tumorigênicas. Para os ensaios, serão desenvolvidos três modelos celulares de hepatócitos não tumorigênicos e tumorigênicos. Os dois primeiros serão compostos pelas linhagens humanas normais PHH (hepatócitos primários imortalizados não tumorigênicos) e HepaRG/diferenciadas, que serão transfectadas para superexpressar a enzima SCD1. O terceiro consiste na linhagem de carcinoma hepatocelular HepG2, que será utilizada para a indução de um perfil de resistência ao inibidor comercial de SCD1, onde as células resistentes serão isoladas e estudadas frente às linhagens parentais sensíveis a este composto. Além disto, para este último modelo, também será determinado o perfil metabólico de células de HCC resistentes ao tratamento com inibidores para esta enzima, afim de descrever possíveis alvos terapêuticos. Após o estabelecimento dos três modelos celulares, serão realizados os ensaios biológicos, os quais serão comuns para todas as linhagens, como por exemplo a viabilidade celular determinada por meio do método colorimétrico de MTT. Em seguida, serão avaliados os parâmetros metabólicos por meio da: análise do perfil lipídico por espectrometria de massa, determinação do consumo de oxigênio e avaliação da acidificação do meio, afim de verificar as alterações decorrentes da superexpressão e/ou inibição da SCD1. Para avaliar a indução de instabilidade genômica nos modelos previamente estabelecidos, serão realizados ensaios para observar: alterações no ciclo celular; formação e morfologia dos fusos mitóticos, distribuição cromossômica; indução de danos globais no DNA e produção de espécies reativas de oxigênio. Além destes, serão investigadas vias de sinalização que provavelmente serão moduladas pela alta expressão de SCD1 ou, sob resistência ou não a inibidores da mesma: PIP3/Akt/PTEN; beta-catenina; ERK1/2, Ciclinas D1 e B1; histonas gH2AX e H2AX; CHK1 e CHK2 (vias de respostas a danos no DNA); LC3B; e p53. Estas proteínas participam de diversos processos, como reparo do DNA, indução ou inibição da proliferação celular, autofagia e indução de algum tipo de instabilidade genômica. Dessa maneira, os resultados obtidos neste projeto irão contribuir para a elucidação do papel da SCD1 no surgimento do HCC e no perfil de resistência frente aos seus inibidores comerciais. Consequentemente, estes achados podem culminar na descoberta de novos alvos moleculares, assim como podem potencializar a validação dos inibidores da SCD1 na prevenção e tratamento do HCCs.