Identificação e investigação funcional de proteínas que interagem com as enzimas Cdc42 e DUSP12 em células humanas sob condições de instabilidade genômica: uma abordagem proteômica

Resumo

Há cerca de cinco anos nosso laboratório investiga a participação de enzimas da família Rho GTPases e fosfatases de especificidade dual (DUSPs) em mecanismos de manutenção de estabilidade genômica que proporcionam às células maior resistência ou sensibilidade a agentes genotóxicos. Por exemplo, mostramos o envolvimento da fosfatase dual DUSP3 (ou VHR) no reparo de danos ao DNA induzidos por radiação ionizante gama em células tumorais, identificando novos alvos/substratos proteicos pelos quais esta fosfatase estaria atuando na manutenção da estabilidade genômica. Em outros casos mostramos que pequenas GTPases típicas RhoA e Rac1 também estão mediando estabilidade genômica através da via de resposta a danos no DNA (DDR) atuando indiretamente sobre a fosforilação de proteínas quinases Chk1/2 e do sensor de danos ³H2AX, levando a uma menor proliferação e sobrevivência quando células deficientes das GTPases são submetidas a estresse genotóxico por radiação ultravioleta. Surpreendentemente e de forma contrária atua a GTPase Cdc42, cuja superativação é que leva a maior sensibilidade de células tumorais a estresse genotóxico, ou seja, os mecanismos regulados por esta enzima estão atuando opostamente nas proteínas de DDR. Até então, como uma enzima estritamente citosólica e membranar, e ainda de funções regulatórias de citosqueleto bem definidas, especula-se que Cdc42 possa ter efetores e/ou reguladores proteicos downstream desconhecidos que estariam correlacionando esta enzima com mecanismos de estabilidade genômica. Outra fosfatase dual que pretendemos investigar, devido a alta homologia de seu domínio catalítico e funções biológicas com DUSP3, é a DUSP12 ou hYVH1. Esta enzima já foi implicada em diversos processos mostrando um efeito citoprotetor em células expostas a estresse oxidativo (interação com a proteína de choque térmico Hsp70), bem como sua presença e influência em grânulos de estresse, partículas que contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e partículas ribossomais, entre outras. Entretanto, quais seriam os alvos proteicos desta fosfatase e os mecanismos moleculares por eles regulados ainda são questões abertas neste campo. Apesar de Cdc42 e DUSP12 serem enzimas de funções bioquímicas totalmente diferentes elas parecem estar mediando funções biológicas similares na instabilidade genômica promovida por agentes genotóxicos que reduzem a proliferação celular. Assim, e de acordo com a experiência adquirida por nosso laboratório, este projeto vem propor respostas para as seguintes hipóteses: 1º) quais seriam os parceiros proteicos da GTPase Cdc42 e prováveis vias de sinalização controladas por ela em condições celulares instabilidade genômica que estariam mediando seu envolvimento na sensibilização de células tumorais a estresse genotóxico?; 2º) quais seriam os substratos enzimáticos e/ou parceiros proteicos da fosfatase dual DUSP12 em condições de instabilidade genômica promovida estresse oxidativo e/ou agentes genotóxicos, por exemplo, que seriam os responsáveis por novas ou já conhecidas funções biológicas atribuídas a esta enzima?Pretendemos identificar moléculas que interagem com estas enzimas, validar estas interações e mostrar que possivelmente existem mecanismos moleculares precisos e pouco conhecidos, envolvendo-as física e/ou quimicamente em mecanismos de estabilidade genômica, sendo que perturbações nas mesmas levariam e levam a distúrbios celulares frentes diferentes tipos de estresse. Esta investigação deverá ser conduzida em diferentes linhagens celulares humanas transformadas ou não, escolhidas especificamente para cada enzima (Cdc42 e DUSP12), e a abordagem experimental deve incluirá técnicas básicas de: biologia molecular e celular, bioquímica, proteômica, microscopia de fluorescência confocal, bioinformática, e outras. Pretende-se mostrar que GTPase reguladoras do citoesqueleto e tirosina fosfatases também são componentes da complexa rede funcional por trás da difícil tarefa de manutenção genômica. (AU)