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Identificação e investigação funcional de proteínas que interagem com as enzimas Cdc42 e DUSP12 em células humanas sob condições de instabilidade genômica: uma abordagem proteômica

Resumo

Há cerca de cinco anos nosso laboratório investiga a participação de enzimas da família Rho GTPases e fosfatases de especificidade dual (DUSPs) em mecanismos de manutenção de estabilidade genômica que proporcionam às células maior resistência ou sensibilidade a agentes genotóxicos. Por exemplo, mostramos o envolvimento da fosfatase dual DUSP3 (ou VHR) no reparo de danos ao DNA induzidos por radiação ionizante gama em células tumorais, identificando novos alvos/substratos proteicos pelos quais esta fosfatase estaria atuando na manutenção da estabilidade genômica. Em outros casos mostramos que pequenas GTPases típicas RhoA e Rac1 também estão mediando estabilidade genômica através da via de resposta a danos no DNA (DDR) atuando indiretamente sobre a fosforilação de proteínas quinases Chk1/2 e do sensor de danos ³H2AX, levando a uma menor proliferação e sobrevivência quando células deficientes das GTPases são submetidas a estresse genotóxico por radiação ultravioleta. Surpreendentemente e de forma contrária atua a GTPase Cdc42, cuja superativação é que leva a maior sensibilidade de células tumorais a estresse genotóxico, ou seja, os mecanismos regulados por esta enzima estão atuando opostamente nas proteínas de DDR. Até então, como uma enzima estritamente citosólica e membranar, e ainda de funções regulatórias de citosqueleto bem definidas, especula-se que Cdc42 possa ter efetores e/ou reguladores proteicos downstream desconhecidos que estariam correlacionando esta enzima com mecanismos de estabilidade genômica. Outra fosfatase dual que pretendemos investigar, devido a alta homologia de seu domínio catalítico e funções biológicas com DUSP3, é a DUSP12 ou hYVH1. Esta enzima já foi implicada em diversos processos mostrando um efeito citoprotetor em células expostas a estresse oxidativo (interação com a proteína de choque térmico Hsp70), bem como sua presença e influência em grânulos de estresse, partículas que contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e partículas ribossomais, entre outras. Entretanto, quais seriam os alvos proteicos desta fosfatase e os mecanismos moleculares por eles regulados ainda são questões abertas neste campo. Apesar de Cdc42 e DUSP12 serem enzimas de funções bioquímicas totalmente diferentes elas parecem estar mediando funções biológicas similares na instabilidade genômica promovida por agentes genotóxicos que reduzem a proliferação celular. Assim, e de acordo com a experiência adquirida por nosso laboratório, este projeto vem propor respostas para as seguintes hipóteses: 1º) quais seriam os parceiros proteicos da GTPase Cdc42 e prováveis vias de sinalização controladas por ela em condições celulares instabilidade genômica que estariam mediando seu envolvimento na sensibilização de células tumorais a estresse genotóxico?; 2º) quais seriam os substratos enzimáticos e/ou parceiros proteicos da fosfatase dual DUSP12 em condições de instabilidade genômica promovida estresse oxidativo e/ou agentes genotóxicos, por exemplo, que seriam os responsáveis por novas ou já conhecidas funções biológicas atribuídas a esta enzima?Pretendemos identificar moléculas que interagem com estas enzimas, validar estas interações e mostrar que possivelmente existem mecanismos moleculares precisos e pouco conhecidos, envolvendo-as física e/ou quimicamente em mecanismos de estabilidade genômica, sendo que perturbações nas mesmas levariam e levam a distúrbios celulares frentes diferentes tipos de estresse. Esta investigação deverá ser conduzida em diferentes linhagens celulares humanas transformadas ou não, escolhidas especificamente para cada enzima (Cdc42 e DUSP12), e a abordagem experimental deve incluirá técnicas básicas de: biologia molecular e celular, bioquímica, proteômica, microscopia de fluorescência confocal, bioinformática, e outras. Pretende-se mostrar que GTPase reguladoras do citoesqueleto e tirosina fosfatases também são componentes da complexa rede funcional por trás da difícil tarefa de manutenção genômica. (AU)

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Publicações científicas (10)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
MAGALHAES, YULI T.; CARDELLA, GIOVANNA D.; FORTI, FABIO L.. Exoenzyme C3 transferase lowers actin cytoskeleton dynamics, genomic stability and survival of malignant melanoma cells under UV-light stress. JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY B-BIOLOGY, v. 209, . (17/01451-7, 19/05736-1, 15/03983-0, 18/01753-6)
SILVA, LUIZ E.; SOUZA, RENAN C.; KITANO, EDUARDO S.; MONTEIRO, LUCAS F.; IWAI, LEO K.; FORTI, FABIO L.. Proteomic and Interactome Approaches Reveal PAK4, PHB-2, and 14-3-3 eta as Targets of Overactivated Cdc42 in Cellular Responses to Genomic Instability. JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, v. 18, n. 10, p. 3597-3614, . (13/07467-1, 08/58264-5, 18/01753-6)
RUSSO, LILIAN C.; FERRUZO, PAULT Y. M.; FORTI, FABIO L.. Nucleophosmin Protein Dephosphorylation by DUSP3 Is a Fine-Tuning Regulator of p53 Signaling to Maintain Genomic Stability. FRONTIERS IN CELL AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY, v. 9, . (18/01753-6, 15/03983-0)
PEREIRA, NADINE RANIERI; RUSSO, LILIAN CRISTINA; FORTI, FABIO LUIS. UV Radiation-induced Impairment of Cellular Morphology and Motility is Enhanced by DUSP3/VHR Loss and FAK Activation. Cell Biochemistry and Biophysics, v. 79, n. 2, . (15/03983-0, 18/01753-6)
DE LIMA LUNA, ARTHUR CASSIO; FORTI, FABIO LUIS. Modulation of SCD1 activity in hepatocyte cell lines: evaluation of genomic stability and proliferation. Molecular and Cellular Biochemistry, v. 476, n. 9, p. 3393-3405, . (18/01753-6, 17/12775-8)
MAGALHAES, YULI T.; FARIAS, JESSICA O.; SILVA, LUIZ E.; FORTI, FABIO L.. GTPases, genome, actin: A hidden story in DNA damage response and repair mechanisms. DNA Repair, v. 100, . (18/01753-6, 17/16491-4, 15/03983-0, 17/01451-7)
RUSSO, LILIAN CRISTINA; FARIAS, JESSICA OLIVEIRA; FORTI, FABIO LUIS. DUSP3 maintains genomic stability and cell proliferation through modulation of the NER pathway and cell cycle regulatory proteins. CELL CYCLE, v. 19, n. 12, . (17/16491-4, 15/03983-0, 18/01753-6)
MAGALHAES, YULI T.; SILVA, GISELE E. T.; OSAKI, JULIANA H.; ROCHA, CLARISSA R. R.; FORTI, FABIO L.. RHOAming Through the Nucleotide Excision Repair Pathway as a Mechanism of Cellular Response Against the Effects of UV Radiation. FRONTIERS IN CELL AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY, v. 8, . (08/58264-5, 11/05822-3, 10/09453-0, 18/01753-6, 15/03983-0, 10/20506-8, 17/01451-7)
MONTEIRO, LUCAS FALCAO; FORTI, FABIO LUIS. Network analysis of DUSP12 partners in the nucleus under genotoxic stress. JOURNAL OF PROTEOMICS, v. 197, p. 42-52, . (08/58264-5, 18/01753-6)
FACHI, JOSE LUIS; FELIPE, JAQUELINE DE SOUZA; PRAL, LAIS PASSARIELLO; DA SILVA, BRUNA KARADI; CORREA, RENAN OLIVEIRA; PEREIRA DE ANDRADE, MIRELLA CRISTINY; DA FONSECA, DENISE MORAIS; BASSO, PAULO JOSE; SARAIVA CAMARA, NIELS OLSEN; DE SALES E SOUZA, ERICKA LORENNA; et al. Butyrate Protects Mice from Clostridium difficile-Induced Colitis through an HIF-1-Dependent Mechanism. CELL REPORTS, v. 27, n. 3, p. 750+, . (17/16280-3, 16/23142-3, 17/25679-7, 15/01507-7, 12/10653-9, 17/26366-2, 18/01753-6, 17/01451-7, 13/06810-4, 15/06134-4, 14/03002-7, 17/06577-9, 18/02208-1)

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