Emprego do gene repórter luciferase para determinação de atividade de reparo de DNA em células animais

Resumo

O material genético celular está constantemente sujeito a uma variedade de agentes lesivos que podem gerar danos ao DNA, com a consequente instabilidade genômica. No entanto, virtualmente todas as células contam com um complexo sistema de reparo de DNA que mantém aintegridade do material genético. Não obstante, células tumorais e várias doenças genéticas estãoassociadas a deficiências no reparo de DNA. Neste projeto pretendemos aproveitar o eficaz gene repórter da luciferase em duas estratégias para avaliar processos de reparo de DNA em dois diferentes contextos biológicos. O uso de genes repórteres, como o que codifica a proteína luciferase, permite a avaliação do reparo de DNA celular a partir de determinação da atividade dessa enzima, cuja transcrição é reduzida na presença de lesões. Dessa forma, a existência de processos de reparo de DNA resulta em uma expressão mais elevada do gene repórter contendo lesões induzidas por agente genotóxico, em relação a células deficientes em reparo de DNA. A essa atividade se denomina reativação pela célula hospedeira (HCR, do inglês, Host cell reactivation). Pretendemos nesse projeto utilizar essa metodologia para avaliar a funcionalidade de alelos de genes de reparo e investigar a participação de diferentes sistemas de reparo no processamento de lesões oxidativas e lesões causadas por quimioterápicos, induzidas diretamente no DNA plasmidial de expressão do gene repórter. Além disso, pretendemos desenvolver sistemas de avaliação de crescimento tumoral in vivo, empregando células tumorais portadoras desse gene. Nesta etapa investigaremos a importância da proteína p53 na progressão tumoral de células de glioma humano inoculados em animais, tratados com agentes quimioterápicos. Para isso, inicialmente serão estabelecidas linhagens de glioma comp53 selvagem ou mutado que expressem constitutivamente o gene repórter luciferase. A metodologia de imageamento de bioluminescência in vivo permitirá avaliar a eficiência do quimioterápico no crescimento do tumor. Acreditamos que estas abordagens nos permitirão conhecer melhor as respostas de células humanas a esses agentes quimioterápicos, assim como identificar alvos potenciais para serem empregados como co-adjuvantes em processos terapêuticos. (AU)