Melatonina e câncer de ovário: avaliação do metabolismo energético, estresse oxidativo e modulação de células-tronco mesenquimais

Resumo

O câncer de ovário (CO) é a neoplasia ginecológica mais letal que afeta as mulheres com altas taxas de recorrência e progressão, e parte das pacientes desenvolvem quimioresistência. A proliferação celular descontrolada representa uma das principais características da doença neoplásica e, para tal, as células tumorais ajustam o seu metabolismo energético em favor do rápido crescimento; esse padrão metabólico é muito diferente daquele encontrado nas células saudáveis. Evidências sugerem que o microambiente tumoral das neoplasias é composto por populações heterogêneas de células com diferentes níveis de malignidade e que o tumor é impulsionado por um subconjunto de células especializadas, caracterizadas por auto-renovação e multipotência, designadas como células-tronco cancerosas (CTC). As CTC podem se originar de células-tronco mesenquimais (CTMs), e estão sujeitas a diferenciação maligna ou a fibroblastos associados ao câncer (FACs) A melatonina é um hormônio produzido e secretado pela glândula pineal no período do escuro e, mais recentemente, sua produção tem sido evidenciada nas mitocôndrias das células; no CO, a concentração de melatonina está bastante reduzida. Experimentos envolvendo modelos animais e cultura celular de CO já documentaram as propriedades antitumorais da melatonina. O objetivo do presente estudo é avaliar a ação da terapia com melatonina sobre o metabolismo energético, estresse oxidativo e diferenciação neoplásica de CTMs derivada de tecido adiposo utilizando células de carcinoma ovariano humano de alto e baixo grau (linhagens SKOV-3 e CAISMOV24). No experimento in vitro, as duas linhagens serão divididas em grupo controle e grupos expostos à melatonina (as doses serão estabelecidas com base em ensaio IC50) na presença ou ausência de luzindole. Será realizado o teste de citotoxicidade celular por MTT, e ensaio de migração e invasão celular utilizando insertos. Para verificação dos efeitos dos tratamentos com melatonina sobre o metabolismo energético celular serão quantificadas as atividades das seguintes enzimas: glicose-6 fosfato desidrogenase (G6PDH, E.C. 1.1.1.49), fosfofrutokinase 1 (PFK-1, E.C. 2.7.1.11), complexo piruvato desidrogenase (PDH, E.C. 1.2.4.1) e seu regulador piruvato desidrogenase kinase (PDK, E.C. 2.7.11.2), citrato sintase (CS, E.C. 4.1.3.7), beta-hidroxiacil-coA desidrogenase (OHADH, E.C. 1.1.1.35), lactato desidrogenase (LDH, E.C. 1.1.1.27). Também serão quantificados os níveis das proteínas GLUT1, HIF-1±, G6PDH, PDK e PDH por Western blot. Os perfis de consumo de glicose e produção de lactato serão analisados, por espectrofotometria, bem como o metabolismo da glutamina (glutaminólise). As enzimas ligadas ao estresse oxidativo como superóxido dismutase (SOD, E.C. 1.15.1.1), catalase (CAT, E.C. 1.11.1.6) e glutationa peroxidase (GSH-Px, E.C. 1.11.1.9), bem glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), e os níveis de peroxidação lipídica, por meio da formação de malondialdeído, serão investigadas por espectrofotometria. Também será avaliado o perfil de moléculas de sinalização celular envolvida com agressividade tumoral e os níveis de melatonina. Serão ainda conduzidos ensaios para observar o efeito do meio condicionado proveniente de cada linhagem celular sobre a outra, acompanhado ou não dos tratamentos com melatonina e paclitaxel, na presença de CTMs, avaliados em sistema de cultivo independente ou co-cultura indireta. Após os tratamentos, serão obtidos os exossomos avaliados por espectrometria de massas. Ensaios de imunofenotipagem envolvendo marcadores para diferenciação em CTC e FACs serão realizados por citometria de fluxo em cada linhagem celular. Esperamos compreender os efeitos da melatonina sobre o metabolismo energético, o papel do estresse oxidativo no CO e como a melatonina pode alterar a diferenciação de CTMs. Será possível entender os possíveis mecanismos pela qual a melatonina atua na célula de CO de alto e baixo grau, mostrando seu benefício para o tratamento do CO. (AU)