Identificação de genes de Streptococcus sanguinis envolvidos na capacidade desta espécie de invadir, persistir e alterar as funções de células endoteliais humanas

Resumo

Streptococcus sanguinis é uma espécie comensal ubíqua do microbioma bucal associada a infecções cardiovasculares, por mecanismos pouco compreendidos. Recentemente, verificamos que cepas S. sanguinis são capazes de invadir e persistir no interior de células endoteliais (CE) primárias de artéria coronária humana (HCAEC), uma função importante de persistência bacteriana em tecidos cardiovasculares. Há evidências de que este processo requer a expressão de genes para a invasão de S. sanguinis mediada pelo soro em CE (pepO, cppA, srtA) e para a persistência bacteriana no ambiente intracelular (nox, spxB e swan). O objetivo deste projeto é investigar o papel de pepO, cppA, srtA, nox, swan e srtA na capacidade de S. sanguinis invadir e persistir no interior CE humanas, assim como de alterar a viabilidade e as funções angiogênicas destas células. Para isto, cepas mutantes knockout destes genes obtidas em projetos anteriores (SKpepO, SKcppA, SKspxB) ou a serem construídas neste projeto (SKsrtA, SKnox, SKswan) serão comparadas com a cepa parental SK36 (capaz de invadir CE) quanto à frequência de invasão e sobrevida em HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) e HCAEC. Mutantes complementados com cópia episomal dos genes inativados serão usados como controles. HUVEC e/ou HCAEC serão expostas às cepas pré-tratadas ou não com 20% de soro humano durante períodos crescentes de tempo e os números de bactérias viáveis intracelulares determinadas em ensaios de proteção antibiótica. Além disso, a viabilidade e o potencial angiogênico das HUVEC e/ou HCAECs expostas às cepas parental e mutantes serão respectivamente determinados em ensaios de MTT e de formação de tubos. As cepas serão também analisadas quanto à cinética de viabilidade em sangue ex vivo e quanto à ligação a C3b do sistema complemento, a ser medido em cepas tratadas com soro humano por citometria de fluxo. Os resultados deste projeto poderão revelar mecanismos de invasão e persistência de S. sanguinis em CE e assim, fornecer bases para o desenvolvimento de terapias para controle de infecções do sistema cardiovascular por estreptococos. (AU)