Development of molecular markers to distinguish yeast strains (Saccharomyces cerevisiae) during fermentation in ethanol plants.

• Grant number: 11/00087-3
• Support Opportunities: Scholarships in Brazil - Innovative Research in Small Business - PIPE
• Start date: January 01, 2011
• End date: December 31, 2012
• Field of knowledge: Biological Sciences - Genetics - Molecular Genetics and Genetics of Microorganisms
• Principal Investigator: Debora Colombi
• Grantee: Debora Colombi
• Company: Genotyping Laboratório de Biotecnologia Ltda (Genotyping)

Abstract

O Brasil é atualmente o maior produtor mundial de álcool de cana de açúcar, sendo responsável por uma produção anual de aproximadamente 22 bilhões de litros. A produção de álcool se dá através da fermentação do caldo de cana-de-açúcar e/ou melaço por células de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae. No Brasil várias indústrias acompanham a dinâmica populacional da fermentação por cariotipagem. No entanto este método é dispendioso, demorado e pouco acurado quando se compara a outros métodos moleculares mais sensíveis. Diante disso, este projeto se propõe a desenvolver técnicas de microssatélites e de SNPs para identificar as diferentes linhagens de S. cerevisiae presentes no processo de fermentação em usinas de álcool e utlizado para identificar as principais cepas.Para tanto, onze loci de microssatélites previamente descritos na literatura foram utilizados nas reações de microssatélites utilizando como molde as quatro principais cepas selecionadas (BG-1, CAT-1, PE-2 e SA-1). Dos onze loci testados dois não geraram produtos de amplificação, três foram monomórficos e seis foram polimórficos. Entre os polimórficos quatro foram selecionados (locus A, C, I2 e H) para monitorar a fermentação. Entretanto, o locus A e I2 apresentaram o mesmo padrão.Para dar continuidade ao trabalho, na Fase II, pretendemos realizar a amplificação multiplex com diferentes microssatélites para aumentar a confiabilidade do método de genotipagem de leveduras. Para uma melhor definição dos produtos amplificados as amostras serão testadas não mais em eletroforese de agarose, mas em eletroforese capilar. Isto porque na primeira fase do projeto tentamos realizar a análise do multiplex em gel de agarose e a definição não foi satisfatória.Em relação ao estudo dos SNPs, as cepas BG-1, CAT-1, PE-2 e SA-1 tiveram vários genes amplificados e seqüenciados. A comparação das sequencias mostrou a presença de SNPs exclusivos de cada uma das 4 cepas padrões. Para a Fase 2, iremos sequenciar 20 colônias diferentes de cada cepa parara a confirmação da presença dos SNPs observados na Fase I do projeto, para que a seguir, sejam desenhadas as sondas de TaqMan específicas para cada cepa. Serão desenhadas sondas para identificarmos todas as cepas de S. cerevisiae e as Saccharomyces não cerevisiae. Através deste método, além de identificar as diferentes cepas, poderemos quantificá-las diretamente da amostra inicial sem a necessidade de plaqueamento das leveduras