Cloning and characterization of Arapaima gigas (pirarucu) prolactin

• Grant number: 19/07343-7
• Support Opportunities: Scholarships in Brazil - Technical Training Program - Technical Training
• Start date: August 01, 2019
• End date: September 30, 2020
• Field of knowledge: Biological Sciences - Genetics - Animal Genetics
• Principal Investigator: João Ezequiel de Oliveira
• Grantee: Vanessa de Luna Yosidaki
• Host Institution: Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). São Paulo , SP, Brazil
• Associated research grant: 17/26369-1 - Synthesis, purification and characterization of the gonadotropins of pirarucu (Arapaima gigas): ag-FSH and ag-LH, AP.R

Abstract

A) Construção dos vetores de expressão para produção de ag-LH em células CHO e obtenção de uma linhagem estável de células produtoras. Será seguida a metodologia já padronizada no Laboratório de Hormônios do IPEN para o FSH humano (Sevilhano, 2017), mediante construção e co-transfecção dos dois vetores para a expressão da ag-GTH-± e ag-LH-². Como no caso da obtenção do ag-FSH, após a escolha dos clones mais produtivos, será realizada a amplificação gênica mediante cultivo em suspensão de células HEK 293. Será considerada útil uma produção de pelo menos 1 µg de ag-LH por ml de meio de cultura condicionado. B) Purificação de ag-LH A purificação será realizada após obtenção de aproximadamente 10 litros de meio condicionado de HEK293 produtoras de agLH. A técnica de purificação será derivada de metodologias já dominadas pelo Laboratório de Hormônios do IPEN para a purificação de TSH humano (Ribela,2003; Mendonça, 2005; Oliveira, 2007; Ventini, 2011) oportunamente modificadas. C) Caracterização do ag-LH purificado obtido. Serão realizados todos os testes físico-químicos, imunológicos e biológicos já padronizados no Laboratório de Hormônios para outras glicoproteínas hormonais e que, obviamente, deverão ser oportunamente adaptados para este hormônio nunca sintetizado antes: SDSPAGE, Western blotting, HPLC de exclusão molecular, HPLC em fase reversa, MALDI-TOF e ensaio biológico pelo incremento de peso da vesícula seminal em ratos machos (19-22 dias de idade) (Oliveira, 2003; 2008; Loureiro, 2006; Ribela,2006; Carvalho, 2009; Almeida, 2010).