Characterization of the cellular effects of the mono-N-butyl phthalate (MBP) mediated by non-genomic estrogen pathway activated by GPR30 in human prostate tumor cells

Author(s)

André Rebelo Peixoto

• Document type: Master's Dissertation
• Press: Botucatu. 2016-06-30.
• Institution: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências. Botucatu
• Defense date: 2016-03-04
• Advisor: Wellerson Rodrigo Scarano

Abstract

O mono-n-butil-ftalato (MBP), metabólito ativo do di-n-butil-ftalato (DBP), plastificante usualmente utilizado em produtos industrializados, incluindo dispositivos médicos, plásticos flexíveis e cosméticos, tem sido descrito como um desregulador endócrino com função estrogênica e anti-androgênica dependendo da dose e do período de exposição, interferindo principalmente com o desenvolvimento do sistema genital masculino. Acredita-se que os efeitos de alguns desreguladores endócrinos sejam mediados pelo receptor estrogênico não clássico acoplado à proteína G - GPER1 (GPR30). Tendo em vista a problemática mundial com relação à degradação dos materiais plásticos e sua dispersão no meio ambiente e diante de evidências que mostraram que os ftalatos exercem efeitos sobre o desenvolvimento e maturação da próstata aumentando a incidência de lesões inflamatórias e displásicas em roedores, este estudo teve por objetivo avaliar a ação do MBP sobre células cancerígenas prostáticas dependentes de andrógeno (LNCaP), modulando a atividade do GPER1 (através de seu antagonista, G15). As células da linhagem LNCaP, mantidas em meio de cultura RPMI, foram expandidas e tratadas em estufa com 5% de CO2 e atmosfera úmida a 37ºC. A dose de MBP a ser utilizada foi de 10 µM, selecionada após o teste de citotoxicidade do MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2yl]-2,5-difenil brometo de tetrazolina). Dessa forma foram constituídos os seguintes protocolos de tratamento: Controle: RPMI + DMSO 0,03%; MBP: 10 µM de MBP diluído em DMSO (0,03%) + RPMI; G15: 8 µM de G15 diluído em DMSO (0,03%) + RPMI; M+G: 8 µM de G15 + 10 µM de MBP (diluídos em DMSO 0,03%) + RPMI. Para o tratamento conjunto de MBP com G15 (M+G) o antagonista de GPER1 foi acrescentado ao meio 30 minutos antes do MBP. As células foram incubadas segundo os tratamentos descritos em quatro tempos diferentes: 15 minutos, 45 minutos, 3 horas e 12 horas. Após a exposição, seguiu-se o processamento das células para extração de RNA e proteínas, destinadas às técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real após Transcrição Reversa (RT-qPCR) e Western blot, respectivamente. Em todos os tempos foram avaliados o perfil da expressão proteica para GPER1, pErk1/Erk2, PI3K e pAKT para a avaliação global do processo de ativação das vias mediadas por GPER1. Após essa etapa, e evidenciando um efeito rápido do MBP na ativação de GPER1, selecionamos o tempo de 12 horas para avaliar as possíveis repercussões tardias dos tratamentos sobre genes e proteínas relacionadas a via do GPER1 e outras vias importantes no processo de progressão tumoral. Utilizando os mesmos protocolos de tratamento foi realizado o ensaio de migração transwell plaqueando 1x105 células em insertos translúcidos que foram posteriormente avaliados por microscopia de fluorescência para a quantificação das células que atravessaram os poros. O ensaio de migração celular transwell mostrou que o tratamento com o MBP foi capaz de aumentar a migração das células LNCaP, ao passo que os demais tratamentos foram semelhantes ao controle. Os dados iniciais mostraram que o MBP foi capaz de aumentar a expressão de GPER1, pERK1/2 após 45 minutos de exposição, mas não alterou a expressão de PI3K e pAKT. Após 3 horas de exposição houve um aumento na expressão de GPER1 e pERK1/2 no grupo tratado com o antagonista G15, e com 12 horas o nível dessas proteínas foi semelhante em todos os grupos. Esses dados nos levam a crer que o MBP ativa a via de GPER1 em um curto período de tempo aumentando preferencialmente a fosforilação de ERK1/2. Após a ativação rápida de GPER1 pelo MBP e inibição pelo G15 (45 minutos), parece que se estabelece um período em que as células que tiveram a via do GPER1 inibida (G15) e parcialmente inibida (M+G) e que, deixaram de fosforilar por essa via ERK1/2 e AKT, aumentam consideravelmente a expressão dessas proteínas fosforiladas para ativar vias essenciais de sobrevivência celular (3 horas). Após 12 horas de exposição, a expressão de genes como GPER1, EGFR, AKT1, MAPK1 e MAPK3 mostra-se diminuída no grupo MBP, o que pode sinalizar a tentativa de reequilíbrio dos níveis celulares das proteínas traduzidas a partir desses genes, o que se comprova pelos ensaios de western blot. Dessa forma conclui-se que o MBP, na dose estudada, é capaz de ativar a via do GPER1 por um curto período de tempo, principalmente fosforilando ERK1/2, inclusive aumentando a capacidade migratória dessas células, o que poderia ao longo do tempo e de exposições múltiplas aumentar a progressão tumoral; e que as células LNCaP por mecanismos de controle celular reduzem a resposta ao MBP ao longo do tempo, na tentativa de reequilibrar as vias de sobrevivência celular associadas ao GPER1. (AU)

• FAPESP's process: 14/09191-6 - Characterization of the cellular effects of the mono-n-butyl phthalate (MBP) mediated by non-genomic estrogen pathway activated by GPR30 in human prostate tumor cells
• Grantee: Andre Rebelo Peixoto
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