Influence of genetic alterations, fluconazole and hydrolytic enzymes on the extracellular matrix of fluconazole-susceptible and -resistant Candida biofilms

Author(s)

Beatriz Helena Dias Panariello

• Document type: Doctoral Thesis
• Press: Araraquara. 2018-01-26.
• Institution: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Faculdade de Odontologia. Araraquara
• Defense date: 2017-08-04
• Advisor: Ana Cláudia Pavarina; Marlise Inêz Klein

Abstract

Biofilmes formados por Candida estão relacionados a infecções bucais, como a candidíase. Embora a resistência do biofilme seja multifatorial, a proteção exercida por sua matriz extracelular (MEC) é importante para os altos níveis de resistência a drogas antifúngicas. O conhecimento dos princípios estruturais da MEC possibilita maior compreensão de como atuar para desorganizá-la e melhorar a difusão de agentes antifúngicos para que atinjam mais eficientemente o biofilme, além de, futuramente, possibilitar o desenvolvimento de terapias mais eficazes para o controle da formação de biofilmes. Sendo assim, os objetivos principais deste estudo foram: (1) verificar a influência da inativação de genes envolvidos na filamentação (EFG1 e TEC1) em características estruturais dos biofilmes e na produção de componentes da MEC; (2) verificar a influência do fluconazol (FLZ) na MEC de biofilmes de Candida albicans ATCC 90028 (susceptível a fluconazol- CaS), C. albicans ATCC 96901 (resistente a fluconazol- CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (susceptível a fluconazol- CgS) e C. glabrata ATCC 200918 (resistente a fluconazol- CgR) e (3) estudar a ação de enzimas hidrolíticas (DNase, Dextranase e β-glucanase individualmente ou em diferentes combinações) sobre a MEC de biofilmes de CaS e CaR. Biofilmes maduros (48 horas) foram analisados através de contagem de unidades formadoras de colônia (ufc/mL), peso seco total, peso seco insolúvel e proteínas insolúveis. Os componentes da MEC- polissacarídeos solúveis em álcali (ASPs), polissacarídeos solúveis em água (WSPs), DNA extracelular (eDNA) e proteínas solúveis- foram quantificados. No estudo 1, foi observado que o conteúdo de ASPs é significativamente maior em cepa parental de C. albicans em comparação com as cepas mutantes Δ/Δ efg1 e Δ/Δ tec1, o que indica que a produção de ASPs pode estar relacionada à morfologia celular filamentosa em C. albicans. No estudo 2, observou-se que as biomassas totais e WSPs foram significativamente reduzidos pelo FLZ na MEC de CaS, CaR, CgS e CgR, mas as quantidades de eDNA e proteínas não foram influenciadas pela presença de FLZ nem pelo tipo de cepa. O FLZ interferiu na morfologia celular e na estrutura dos biofilmes, reduzindo a formação de hifas nos biofilmes de CaS e CaR e diminuindo o número de células nos biofilmes de CgS e CgR. No estudo 3, observou-se que exposição de biofilmes maduros à DNase por 5 minutos reduziu o conteudo de eDNA, polissacarídeos e proteínas solúveis da MEC de CaS e CaR, sendo um promissor adjuvante para terapias antibiofilme. A redução de polissacarídeos extracelulares e do conteúdo de proteínas pela DNase indicam que esses componentes estão interligados ao eDNA na MEC de CaS e CaR. Portanto, células filamentosas têm tendência de produzirem mais exopolissacarídeos, e estes componentes estão interligados ao eDNA e a proteínas solúveis na MEC de biofilmes de C. albicans. Para reduzir componentes da matriz e desorganizar a estrutura formada por eDNA-exopolissacarídeos-proteínas, a aplicação de enzima DNase por 5 min em biofilmes maduros de C. albicans se mostrou eficaz (AU)

• FAPESP's process: 14/18804-1 - Extracellular matrix of susceptible and fluconazole-resistant Candida albicans and Candida glabrata biofilms: characterization, action of hydrolytic enzymes and efficacy of the combination of enzymes to Photodynamic Therapy.
• Grantee: Beatriz Helena Dias Panariello
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