Desenvolvimento e utilização de técnicas de fluorescência para o estudo de alterações conformacionais em proteínas

Resumo

O principal objetivo do presente projeto é o desenvolvimento e aplicação de técnicas utilizando ensaios de fluorescência visando o estudo de alterações conformacionais em proteínas, mais especificamente em enzimas proteoliticas. Pretendemos usar como primeiro alvo a timet oligopeptidase (TOP, EC 3.4.24.15), sendo que esta enzima pode sofrer alterações conformacionais devido à interação com substratos ou inibidores. A estrutura dessa peptidase apresenta dois domínios compostos praticamente por estruturas alfa-hélice, sendo que, entre estes dois domínios forma-se um "profundo canal" onde o sítio ativo fica localizado, e que pode se fechar ao redor do substrato durante a catálise.TOP mutantes serão preparadas com a introdução por mutação sítio dirigida de um par de sondas, ficando uma de cada lado do canal central presente na estrutura da TOP. Tais sondas poderão ser: resíduos de triptofano (doadores de fluorescência) ou resíduos de aminoácidos não naturais (doadores ou aceptores de fluorescência), e o desenvolvimento da metodologia para a introdução de tais resíduos de aminoácidos não naturais em posições específicas nessas proteínas, é na verdade, por si um dos grandes objetivos do presente projeto.Subseqüentes experimentos de fluorescência no estado estacionário e fluorescência resolvida no tempo serão então realizados na presença de diferentes substratos e inibidores desta peptidase, para se analisar o movimento de "fechamento" do canal ao redor do ligante no centro ativo.