Estudo do controle da expressão gênica e plasticidade genética em Leishmania

Resumo

Essa proposta está dirigida a estudos sobre processos e mecanismos de regulação da expressão gênica, recombinação e plasticidade genética, associados a abordagens de genômica comparativa in silico e laboratoriais no parasita Leishmania. Os estudos e abordagens propostos são uma continuação do trabalho que vimos desenvolvendo anteriormente (sob financiamento da FAPESP- 99112403-3). A investigação da presença e mecanismo de ação dos ncRNAs em Leishmania é um tópico que consideramos de alta relevância e os resultados acumulados com o trabalho que vimos desenvolvendo são encorajadores e trazem conceitos novos. As tentativas de demonstrar a existência de uma maquinaria de interferência de RNA similar à de T brucei em L. major não tiveram sucesso, pois é possível que as abordagens experimentais utilizadas sejam inadequadas em função de diferenças desconhecidas na maquinaria de cada organismo. Assim, nossa proposta é ir além da descrição de um fenômeno e investigar o modo de ação de um dos ncRNA, nomeado ODD3, que claramente exerce um efeito sobre a expressão de outros genes levando a alterações fenotípicas marcantes. Investigaremos a interação entre RNAs para entender o papel da seqüência primária e estrutura secundária no efeito observado e também eventual interações entre transcritos e proteínas que possam fazer parte da cascata de eventos desencadeada pela presença de transcrito de ODD3 em excesso. Um outro alvo de investigação sobre regulação de expressão gênica é a proteína ribossomal, L19, pois observamos alteração dos níveis de seu transcrito entre promastigotas e amastigotas de L.major. Some-se ainda a relevante observação de que o padrão de expressão de L19 é diferente em L.braziliensis, onde altos níveis de transcrito são observados em promastigotas, em qualquer fase da cultura. Assim, nossos resultados preliminares nos encorajam a investigar se essa proteína ribossomal tem papel extraribossomal relacionado com controle de expressão gênica, como descrito para outros organismos. Outros mecanismos de regulação de expressão gênica serão abordados e envolvem genes que vimos estudando anteriormente como os que codificam para as isoformas citosólica e glicossômica da fosfoglicerato quinase (PGK) em L. major. Já demonstramos o envolvimento da região 3' não traduzida (3 'UTR) no controle da expressão da isoforma glicossômica e pretendemos delimitar a região responsável pelo controle bem como estabelecer se a localização glicossômica da proteína exerce sobre ele algum efeito. Além disso, para ir além da descrição do fenômeno, e dependendo do estabelecimento das técnicas de investigação de interações proteína-RNA que empregaremos para estudar a L19, também vamos investigar proteínas que interajam com a região controladora da PGKC. O outro tema que vimos investigando engloba processos de recombinação genética observados em Leishmania e seu papel na plasticidade genética. Nas tentativas de disrupção de um gene essencial, de extremidade cromossômica, observamos mudanças genotípicas que não podem ser explicadas pelos modelos propostos de amplificação e rearranjo de DNA para Leishmania. Temos resultados preliminares que sugerem haver recombinação entre seqüências presentes nas extremidades dos cromossomos com elementos de epissomos circulares e não há qualquer relato anterior que descreva fenômeno semelhante em Leishmania. Assim sendo, toma-se importante utilizar os mutantes gerados para investigar o fenômeno de recombinação e definir eventuais fatores relacionados aos processos de recombinação observados...(AU)