Caracterizacao dos efeitos do amblyomin-x sobre a angiogenese e sobre a funcao de macrofagos.

Resumo

Amblyomin-X é uma proteína recombinante inibidora de serinoprotease, isolada da glândula salivar do carrapato Amblyomma cajannense. Esta toxina é capaz de inibir fator X ativado; induzir apoptose em diversas linhagens de melanomas humanos ou murinos; ativar macrófagos peritoneais, além de reduzir a formação de tumores in vivo. Este último efeito parece ser dependente, pelo menos em parte, da inibição da angiogênese. Com base nas informações acima, o presente projeto tem o objetivo de caracterizar os efeitos do amblyomin-X sobre a formação de novos vasos e sobre a função de macrófagos, com o intuito de esclarecer os mecanismos envolvidos no efeito antitumoral. Para caracterizar o efeito da toxina sobre a formação dos vasos in vivo, será empregado o modelo da câmara dorsal em Camundongos Swiss, machos, com peso entre 18-20 g e idade de 3 a 4 meses. Por meio de microscopia intravital, a rede microcirculatória no tecido subcutâneo dorsal será avaliada antes e após diferentes protocolos de tratamentos com a toxina em condições basais, na vigência da ação de fator de crescimento vascular ou durante o crescimento tumoral. As ações da toxina sobre apoptose/necrose, proliferação, migração e expressão de moléculas de adesão será avaliada em célula endotelial em cultura da linhagem tEnd (obtida de hemangioma de timo de camundongos e transformadas por polioma vírus) na vigência ou ausência de fator de crescimento vascular. A migração celular será acompanhada em microscópio óptico invertido; a proliferação celular, as expressões de moléculas de adesão a5b3, a51b1, PECAM-1, JAM-c, E-caderina, ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1 e E-selectina e apoptose/necrose serão quantificadas por citometria de fluxo. Com o objetivo de elucidar os efeitos da toxina sobre macrófagos, monócitos serão obtidos de sangue circulante humano e cultivados para polarização em macrófagos M1, M2 ou tumoral. Em seguida, estas células serão incubadas com amblyomin-X e sua função fagocítica, microbicida, capacidade de secreção de citocinas pró ou antiinflamatórias e expressão de MHC de classe II ou moléculas co-estimulatórias serão avaliadas. A atividade fagocítica e microbicida será avaliada frente ao fungo Candida albicans por microscopia ótica, pela quantificação de espécies reativas de oxigênio no sobrenadante das células e pela quantificação do número de unidades formadoras de colônia. As concentrações de citocinas ou fatores de crescimentos TNF-a; IL-1b; IL-10; IL-6; CCL-2, TGFb e VEGF serão quantificados por ensaio imunoenzimático e a expressão de MHC de classe II e moléculas co-estimulatórias será avaliada por citometria de fluxo. É importante ressaltar que este projeto fortalece a linha de estudo sobre angiogênese Laboratório de Toxicologia Experimental e favorecerá a implantação dos estudos em macrófagos polarizados, ainda inéditos em nosso laboratório. Ademais, os resultados que serão obtidos fornecerão as bases para o mecanismo de ação do amblyomin-X e complementarão os estudos do grupo da Dra Ana Marisa Chudizinski-Tavassi, do Instituto Butantan. Este projeto integra a Patente WO/2006/029492 Kunitz-Type recombinant inhibitor. (AU)