Caracterização funcional e estrutural das glutarredoxinas de Saccharomyces cerevisiae: identificação de resíduos relacionados à atividade oxidorredutase.

Resumo

Glutarredoxinas (Grxs) são pequenas oxidorredutases que possuem pelo menos um resíduo de cisteína conservado em seus sítios ativos. Essas oxidorredutases tiólicas são capazes de reduzir pontes dissulfeto de proteínas alvo e dissulfetos mistos entre proteínas ou tióis de baixo peso molecular e glutationa. Grxs estão envolvidas em vários processos vitais para as células, como síntese de DNA, regulação de fatores de transcrição e defesa antioxidante. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, foram identificadas oito glutarredoxinas (ScGrx1-8): ScGrx1, ScGrx2 e ScGrx8 são ditiólicas, enquanto ScGrx3-7 são isoformas monotiólicas. Anteriormente, mostramos que ScGrx2 possui atividade específica como oxidorredutase quinze vezes maior do que ScGrx1, embora estas enzimas compartilhem de uma alta identidade de seqüência e alta similaridade estrutural. E mostramos que essa diferença de atividade está relacionada à substituição dos resíduos Ser23 e Gln52 em ScGrx1 por Ala23 e Glu52 em ScGrx2, possivelmente por que estes resíduos são responsáveis pela orientação da Cys30 do sítio ativo, ou pela desprotonação desta mesma cisteína. Para entender melhor o papel destes resíduos sobre a atividade destas Grxs como oxidorredutases, pretendemos determinar as estruturas cristalográficas dos mutantes ScGrx1-S23A, ScGrx1-S23A-Q52E, ScGrx2-A23S e ScGrx2-A23S-E52Q, e verificar se a orientação da Cys30 é dependente dos resíduos mencionados anteriormente. Além disso, pretendemos determinar também a influência destes resíduos sobre a desprotonação da Cys30, através da determinação do pKa deste resíduo nas proteínas mutantes. A caracterização cinética destes mutantes também pode ajudar a entender melhor os mecanismos de ação de Grxs.Em relação às Grxs monotiólicas de levedura, pretendemos identificar os resíduos de aminoácidos que podem estar relacionados à ausência de atividade como oxidorredutase de ScGrx5 no ensaio clássico com HED. Foi proposto que esta Grx não apresenta atividade neste ensaio por que sua redução por glutationa é ineficiente. Uma vez que ScGrx6-7 são monotiólicas, mas ativas neste ensaio, pretendemos substituir alguns resíduos do sítio de ligação à glutationa destas Grxs em ScGrx5 e verificar se ocorre aumento de atividade com HED. Pretendemos também determinar se ScGrx3 e ScGrx4 são ativas no ensaio com HED e, em caso, negativo, verificar se a substituição de aminoácidos do sítio de ligação com glutationa também tem influência sobre a atividade oxidorredutase destas enzimas. A determinação das estruturas de ScGrx3-5 ligadas à glutationa também pode ajudar a esclarecer as razões para o diferente comportamento entre as Grxs monotiólicas de levedura.