Cafeína, Trigonelina e Ácido Clorogênico: Modulação da expressão de miRNAs na Hepatocarcinogênese associada à Fibrose.

Resumo

Nos últimos anos, os processos fibrose e carcinogênese hepática têm sido relacionados à expressão alterada de diversos miRNAs. Em contraste, estudos indicam que o consumo da bebida café está relacionado com risco 40% menor de desenvolver fibrose ou câncer hepático. Assim, o projeto avaliará se a cafeína isoladamente ou associada à trigonelina e/ou ao ácido clorogênico (ACG): (A) atenua a hepatocarcinogênese associada à fibrose (HAF) em camundongos; (B) atenua a fibrose em co-cultura de hepatócitos tumorais e células estreladas hepáticas (CEHs) e (C) altera o perfil de expressão global de miRNAs e a expressão de genes-alvo dos miRNAs diferencialmente expressos no fígado. In vivo: para a indução da HAF, camundongos C3H/He machos receberão dose única de dietilnitrosamina (intraperitoneal [i.p.], 50 mg/Kg peso corpóreo [p.c.]) no 14º dia pós-natal (DPN). A partir da 8ª até 16ª semana, os animais receberão três doses semanais de tetracloreto de carbono (i.p., dose inicial de 0.25 mg/Kg p.c. e dose máxima de 1.25 mg/Kg p.c.). Além disso, da 7ª até a 17ª semana (1x/dia, 5x/semana), os animais receberão por gavagem cafeína (50 mg/Kg p.c./dia); cafeína e trigonelina (50 e 25 mg/Kg p.c./dia, respectivamente); cafeína e ACG (50 e 25 mg/Kg p.c./dia); cafeína, trigonelina e ACG (50, 25 e 25 mg/Kg p.c./dia) ou somente o veículo (água destilada). Os animais serão eutanasiados ao final da 17ª semana. Amostras hepáticas serão destinadas às análises histológicas: histopatologia (HE), quantificação de fibras colágenas (Picro Sirius Red) e reação de imunoistoquímica para os marcadores de CEHs ativadas (desmina e ±-SMA), macrófagos (F4/80), lesões pré-neoplásicas (CK8/18), proliferação celular (Ki-67) e apoptose (caspase-3 clivada). Também será realizada análise da expressão global de miRNAs (nCounter miRNA Expression Assay). Após identificação dos miRNAs diferencialmente expressos, será realizada predição bioinformática de genes alvos. As listas de genes preditos serão utilizadas para a avaliação da expressão de mRNAs, por RT-qPCR. In vitro: Será realizado co-cultivo 3D de hepatócitos (C3A) e CEHs humanas (LX-2). Inicialmente, a ativação das células estreladas será induzida por tratamento com lipopolissacarídeo (LPS) . Em sequência, a co-cultura será exposta à cafeína (10, 5 ou 2.5 mM), trigonelina (5, 2.5 ou 1.25 mM) ou ACG (5, 2.5 ou 1.25 mM) isoladamente ou em associação durante 24 e 48 horas. Amostras do co-cultivo serão destinadas às análises histológicas: HE, Picro Sirius Red e imunofluorescência para a contagem de CEHs. Outras amostras serão destinadas à determinação de colágeno I e de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, TNF-±, TGF²-1,I-17A e IL-23) por ELISA. Ademais, será avaliada a expressão gênica do colágeno ±1(I), ±-SMA, TGF²-1, MMP-2, MMP-9, MMP-1 e TIMP-1 por qRT-PCR. Por fim, os dados serão analisados estatisticamente por ANOVA ou o teste de Kruskal-Wallis. O nível de significância adotado será de p<0.05.