Caracterização funcional de proteínas do Sistema Ubiquitina Proteassoma de L.infantum

Resumo

Esta cota de bolsa de iniciação científica (IC) dentro da proposta PI-FAPESP visa a produção de nocautes marcados com barcode dos genes relacionados ao processo de ubiquitinação pelas Cullin1-RING ubiquitina ligases (CRL1) de L. infantum. A caracterização dos efeitos dos nocautes gênicos nos mutantes nulos viáveis será realizada por meio de ensaios comparativos do cultivo isolado com o isolado selvagem do parasito nas mesmas condições experimentais. Dentre as análises que serão realizadas, destaca-se o crescimento celular, por meio de comparação das suas curvas de crescimento e efeito no ciclo celular, realizando citometria de fluxo. Esta classe de E3 ligases, que está inserida naquelas do projeto PI, é composta pelas proteínas F-box, SKP1, Cullin1 e RBX1 e foi recentemente descrita neste parasita pelo nosso grupo (2020/15771-6) em trabalho submetido na revista Plos Pathogens. Os genes LINF_240015400, LINF_150014400, LINF_140018100, LINF_330019800, LINF_340019100 e LINF_360032300 codificadores das F-box-like proteins (Flps) 1 a 6 foram encontrados interagindo com SKP1, indicando sua relevância funcional no complexo LinfCRL1 da L. infantum. Além destes, o gene LINF_340026400 (Ubiquitin-like protein) foi encontrado no interactoma de Cullin1, sendo potencialmente a proteína NEDD8, um regulador da montagem do complexo LinfCRL1 que se conjuga covalentemente a Cul1 em complexos ativos. Neste projeto, realizaremos a geração dos mutantes nulos por CRISPR-Cas9 contendo os barcodes (Bar-seq), para serem utilizados dentro do projeto PI juntamente com os demais clones nocautes que serão gerados. Os resultados deste projeto contribuirão para os objetivos do auxílio PI, fornecendo resultados de parte dos genes do Sistema Ubiquitina Proteassoma que serão estudados. Em conjunto, este projeto de IC estudará 7 genes ainda desconhecidos na L. infantum, que fazem parte de um refinado sistema de degradação intracelular essencial para a alternância de hospedeiros deste parasita. Assim, contribuiremos com o entendimento de um sistema recentemente descoberto de E3 ligases que poderá ser utilizado como alvos para o desenho de fármacos leishmanicidas.