Confirmation and functional studies of the interaction between the cell cycle regulatory kinase Nek9 and DPPA4 and APPL1

• Grant number: 10/16270-9
• Support Opportunities: Scholarships in Brazil - Scientific Initiation
• Start date: December 01, 2010
• End date: November 30, 2012
• Field of knowledge: Biological Sciences - Biochemistry - Molecular Biology
• Principal Investigator: Jörg Kobarg
• Grantee: Mayra Bento Lemos
• Host Institution: Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). Campinas , SP, Brazil

Abstract

A proteína cinase NIMA (Never In Mitosis, gene A) é um importante regulador do ciclo celular, agindo na progressão mitótica em Aspergillus nidulans. A NEK9/NERCC1 é uma proteína humana da família de NIMA cinases que regula o alinhamento dos cromossomos e sua segregação na mitose. Possui um domínio catalítico bem conservado entre as NEKs (NIMA related kinases) que se segue por um domínio regulatório C-terminal, o qual contém uma região homóloga à RCC1, um motivo coiled-coil de dimerização, além de possuir um segmento rico em Ser/Thr/Pro. A Nek9 possui ligação específica com a RanGTPase e interação com as proteínas NEK6 e NEK7, consistindo em um homodímero que se auto-ativa in vitro por fosforilação ou in vivo durante a mitose. Podem ocorrer anormalidades durante o fuso mitótico ou desalinhamento cromossômico decorrentes de micro-injeção de anticorpos anti-NEK9 na prófase, resultando em retenção das células na prometáfase, alteração de material genético ou segregação cromossômica aberrante. A NEK9 em conjunto com a NEK6 e NEK7 formam uma nova cascata sinalizadora de regulação da progressão mitótica, ainda pouco compreendida. Visando traçar o perfil de interações que constitui esta cascata de sinalização durante a mitose, este projeto tem como finalidade dar continuidade ao projeto de iniciação científica da aluna Jéssica S. Bernachi (Processo FAPESP: 2008/09996-3), através da confirmação in vitro e in vivo das interações com as proteínas DPPA4 e APPL1, identificadas no duplo-híbrido realizado com a NEK9, no sentido de comparamos com os resultados recentemente obtidos para a NEK6. Para isso, pretendemos realizar a clonagem e expressão dessas proteínas em vetores de expressão em E.coli e células de mamíferos, para a realização do mapeamento de suas interações com a NEK9, bem como estudos funcionais (imunoprecipitação, localização celular e ensaios de fosforilação).