Application of protein microarray to identify substrates of SCF1 (FBXO25) E3 ubiquitin ligase

• Grant number: 10/16464-8
• Support Opportunities: Scholarships in Brazil - Post-Doctoral
• Start date: April 01, 2011
• End date: January 31, 2015
• Field of knowledge: Biological Sciences - Biochemistry - Enzymology
• Principal Investigator: Marcelo Damário Gomes
• Grantee: Felipe Roberti Teixeira
• Host Institution: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brazil
• Associated scholarship(s): 12/09241-8 - Identification of the substrates of the E3 ubiquitin-ligase SCF(Fbxo7) using human proteome microarray, BE.EP.PD

Abstract

A proteína FBXO25 é uma das 70 proteínas do tipo F-box que servem como fatores de especificidade para maior família de E3 ubiquitina-ligases humanas, as do tipo RING (Really Interesting New Gene-BoX 1) oligoméricas denominadas SCF - compostas por Skp1, Cullin1, RBX1 e uma proteína tipo F-box - que estão envolvidas na ubiquitinação de proteínas para degradação via Sistema Ubiquitina Proteassoma (SUP). Menos de 10% das proteínas tipo F-box tem sua função e substratos identificados. Nós mostramos que FBXO25 acumula-se no núcleo celular formando uma nova estrutura subnuclear denominada FANDs (FBXO25 Associated Nuclear Domains) que estão envolvidos na ubiquitinação nuclear. Recentemente, reportamos a identificação de 132 possíveis ligantes de FBXO25 a partir da combinação de duas estratégias proteômicas, TAP (Tandem Affinity Purification) e YTHS (Yeast Two Hybrid System). Um desses, a proteína ²-actina globular interage via C-terminal com o N-terminal de FBXO25 e está enriquecida nos FANDs. A inibição da polimerização de ²-actina promove a desorganização dos FANDs, indicando seu papel na regulação da dinâmica desses corpos. Além disso, anticorpos anti-FBXO25 interferem na transcrição via RNA polimerase II em ensaios de transcrição in vitro. Embora tenhamos avançado nos estudos da funcionalidade de FBXO25 nenhuma das abordagens utilizadas nos permitiu a identificação direta de substratos do complexo SCFFBXO25, o que é fundamental para identificação de sua função como E3 ubiquitina-ligase. Os microarrajnos de proteínas (Protoarrays) possuem mais de 21.000 proteínas humanas imobilizadas direcionalmente em uma lâmina e vem sendo amplamente utilizados na identificação de substratos de uma classe de E3-ligases monoméricas. Não há na literatura nenhum registro do uso de Protoarrays para identificação de substratos de E3-ligases do tipo SCF, devido a dificuldade em se obter esses complexos proteicos ativos. No entanto, em ensaios preliminares de ubiquitinação in vitro sobre os Protoarrays com SCFFXBO25 purificados, obtivemos resultados extremamente promissores, com a identificação de vários alvos ubiquitinados apenas pelo complexo SCFFBXO25 selvagem. No entanto, réplicas e outros controles negativos dos experimentos são necessários para confirmação dos alvos identificados. Somos pioneiros na utilização dessa abordagem proteômica no país e dispomos de uma infra-estrutura e treinamento necessário e suficientes para sua realização. Sendo assim, o presente projeto visa identificar substratos da E3 ubiquitina-ligase SCFFBXO25 utilizando microarranjos de proteínas humanas como ferramenta proteômica.

Scientific publications

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(References retrieved automatically from Web of Science and SciELO through information on FAPESP grants and their corresponding numbers as mentioned in the publications by the authors)

TEIXEIRA, FELIPE ROBERTI; RANDLE, SUZANNE J.; PATEL, SHACHI P.; MEVISSEN, TYCHO E. T.; ZENKEVICIUTE, GRASILDA; KOIDE, TIE; KOMANDER, DAVID; LAMAN, HEIKE. Gsk3 beta and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal, v. 473, n. 20, p. 3563-3580, OCT 2016. (12/09241-8, 10/16464-8)

TEIXEIRA, FELIPE ROBERTI; RANDLE, SUZANNE J.; PATEL, SHACHI P.; MEVISSEN, TYCHO E. T.; ZENKEVICIUTE, GRASILDA; KOIDE, TIE; KOMANDER, DAVID; LAMAN, HEIKE. Gsk3 beta and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal, v. 473, p. 18-pg., 2016-10-01. (10/16464-8, 12/09241-8)

MARUYAMA, SANDRA R.; GARCIA, GUSTAVO R.; TEIXEIRA, FELIPE R.; BRANDAO, LUCINDA G.; ANDERSON, JENNIFER M.; RIBEIRO, JOSE M. C.; VALENZUELA, JESUS G.; HORACKOVA, JANA; VERISSIMO, CECLIA J.; KATIKI, LUCIANA M.; et al. Mining a differential sialotranscriptome of Rhipicephalus microplus guides antigen discovery to formulate a vaccine that reduces tick infestations. PARASITES & VECTORS, v. 10, APR 26 2017. (10/16464-8, 12/15464-0, 12/04087-0)

TEIXEIRA, FELIPE R.; MANFIOLLI, ADRIANA O.; VIEIRA, NICHELLE A.; MEDEIROS, ANA CARLA; COELHO, PRISCILA DE O.; GUIMARAES, DIMITRIUS SANTIAGO; SCHECHTMAN, DEBORAH; GOMES, MARCELO D.. FBXO25 regulates MAPK signaling pathway through inhibition of ERK1/2 phosphorylation. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 621, p. 38-45, MAY 1 2017. (14/10898-7, 10/16464-8, 11/21891-5)