As vias de Cdc42/N-WASP e Rac1/WAVE2 na dinâmica de actina durante a invasão celular pelos amastigotas extracelulares de Trypanosoma cruzi

Resumo

A doença de Chagas é causada pelo protozoáriao flagelado Trypanosoma cruzi. A invasão celular pelas formas amastigotas extracelulares (AE) desse parasito é altamente dependente do citoesqueleto de actina da célula hospedeira cujos mecanismos regulatórios durante essa interação ainda permanecem pouco caracterizados. As GTPases Cdc42 e Rac1 estão envolvidas em diversos processos celulares, mas principalmente na regulação do citoesqueleto de actina onde as suas principais moléculas efetoras, N-WASP e WAVE2 respectivamente, atuam crucialmente como nucleadores da polimerização de actina na formação de filopódios e lamelipódios. Muitos trabalhos mostram a participação de ambas as vias - Cdc42/N-WASP e Rac1/WAVE2 - na regulação do citoesqueleto de actina durante a invasão por parasitos e bactérias, porém ainda não foram estudadas na invasão celular por T. cruzi. Nesse sentido o presente projeto prevê avaliar o papel dessas duas vias na dinâmica de actina durante a invasão celular pelos AEs. Para tanto avaliaremos o (i) recrutamento e (ii) invasão pelos AEs e (iii) interação dessas proteínas utilizando células superexpressando estavelmente suas construções nativas e mutantes fusionadas a marcadores fluorescentes assim como sequências de RNA de interferência que reduzam a expressão das mesmas. Esses três aspectos que caracterizarão o papel de ambas as vias na polimerização de actina durante a invasão celular pelos AEs serão avaliados em células fixadas e vivas; este último por meio de microscopia confocal. Por fim, essa estratégia será também utilizada em estudos de coinfecção em células colonizadas pela bactéria Coxiella burnetii, cuja infecção altera a organização do citoesqueleto da célula hospedeira e, provavelmente, a sinalização que o regula.