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Determinantes estruturais para a especificidade de interação nas interfaces g e NC de septinas: validando as regras de substituição na montagem do filamento

Processo: 16/04658-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de julho de 2016
Vigência (Término): 30 de junho de 2020
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
Pesquisador responsável:Richard Charles Garratt
Beneficiário:Diego Antonio Leonardo Cabrejos
Instituição-sede: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:14/15546-1 - Septinas: estudos comparativos visando correlacionar estrutura e função, AP.TEM
Assunto(s):Septinas   Interação proteína-proteína   Cristalografia de proteínas

Resumo

Septinas são GTPases que desempenham um papel importante na estrutura da célula, formando o quarto componente do citoesqueleto e participando no recrutamento de outras proteínas. Septinas formam heterofilamentos que são estabilizados por interações entre as subunidades através de dois tipos de interface: G e NC. Estas interfaces foram observadas na estrutura cristalografia do heterocomplexo SEPT2-SEPT6-SEPT7, mas devido à baixa resolução (4 Å) não foi possível analisar em detalhe os determinantes estruturais responsáveis pela sua formação assim como para entender a disposição de cada subunidade ao longo do filamento. Mesmo assim, foi observado, por Kinoshita em 2002, que septinas pertencentes ao mesmo grupo podem ocupar posições equivalentes no filamento assim gerando uma diversidade de heterocomplexos. O desafio de entender a especificidade de polimerização do filamento se baseia na observação surpreendente de interfaces promiscuas formadas por septinas isoladas. Tais interações levam a formação de homofilamentos estabilizados por interfaces do tipo G e NC e são observadas em várias estruturas cristalográficas relatadas na literatura, mesmo se não existem em filamentos fisiológicos. Para abordar este fenômeno o nosso grupo inicialmente trabalhou na co-expressão e co-purificação de complexos triméricos e tetraméricos com fins estruturais, mas sem muito êxito devido à falta de equimolaridade nas amostras. Por este motivo o candidato propôs no projeto de mestrado (2014) uma abordagem alternativa, estudar uma única interface, sendo que o estudo foi focado na interface G entre SEPT5 e SEPT8. Os resultados mostram uma maior estabilidade do complexo SEPT5-SEPT8 frente a SEPT8 sozinha, grande tendência à cristalização do heterocomplexo e finalmente foi identificada uma interação entre aminoácidos únicos para estas septinas (Phe131 e Thr19, em SEPT5 e SEPT8 respetivamente), a qual é proposta como a mais importante para a especificidade e estabilidade desta interface G. Este projeto de doutorado propõe ampliar o estudo da especificidade de interação da interface G entre septinas do grupo II (grupo da SEPT8) e grupo III (grupo da SEPT5), validando quantitativamente a observação de Kinoshita, assim como estudar a interação entre Phe131 e Thr19 com o objetivo de entender a sua importância na estabilidade e especificidade na interface. Também será explorada a ideia de que coiled-coils pertencentes a septinas do grupo III são os responsáveis pela estabilidade de complexos de mais alta ordem, onde, coiled-coils antiparalelos podem servir como ligações cruzadas entre filamentos. Finalmente serão feitos estudos de microscopia eletrônica para o complexo SEPT3-SEPT7-SEPT8-SEPT5 com fins de estabelecer a disposição de cada subunidade no filamento. A presente proposta está vinculada ao projeto temático 2014/15546-1 "Septinas: estudos comparativos visando correlacionar estrutura e função".