Avaliação bioquímica, estrutural e funcional de uma fosfodiesterase da peçonha de Crotalus durissus collilineatus

Resumo

As peçonhas ofídicas são constituídas por uma enorme gama de componentes capazes de induzir a diversos sintomas patológicos em vítimas do envenenamento, que faz parte das circunstâncias negligenciadas pela OMS e também é um grave problema de saúde pública no Brasil. No território nacional, o gênero Crotalus é representado pelas serpentes da espécie Crotalus durissus, dispersas em diversas regiões. Sua peçonha apresenta uma grande complexidade de componentes proteicos, podendo influenciar na toxicidade do acidente crotálico, dificultando seu tratamento. Para que o mecanismo de toxicidade dos diversos componentes seja elucidado, é necessário que os mesmos sejam isolados e caracterizados. Desta forma, sua ação no envenenamento se torna conhecida, o que facilita o tratamento de seu sintoma. Devido à complexidade da peçonha de C. d. collilineatus, muitos de seus componentes ainda não foram isolados, como é o caso da fosfodiesterase (PDE). Estas enzimas fazem parte das nucleases, juntamente a DNAse e RNAse, e apresentam elevada massa molecular (90 ~160 kDa), podendo ser encontradas em forma monomérica ou dimérica. As PDEs podem ser classificadas de 1 a 11 e são responsáveis pela quebra das ligações fosfodiéster de ácidos nucléicos, ATP, ADP, NAD, NGD, AMPc e GMPc, sendo capazes de intervir em processos fisiológicos ou patológicos, o que as tornam alvos terapêuticos de diversas patologias, além de atuarem como ferramentas moleculares. Seu papel no acidente ofídico ainda não está totalmente elucidado, mas sabe-se que a PDE é capaz de levar a hipotensão e depressão locomotora da presa e, também, é capaz de inibir a agregação plaquetária in vitro. Sendo assim, este trabalho terá como objetivos realizar o isolamento da PDE da peçonha de C. d. collilineatus, através da combinação de técnicas de cromatografia líquida, sua identificação por técnicas de espectrometria de massas e sequenciamento amino-terminal, a determinação de sua massa molecular, construir seu modelo tridimensional, avaliar sua estabilidade em diferentes condições de pH e temperatura, além de avaliar a atividade fosfodiesterásica sobre o substrato bis(p-nitrofenil)-fosfato em diferentes condições de pH e temperatura e determinar seus parâmetros cinéticos sobre o mesmo substrato, avaliar a especificidade de inibição da enzima por 5 inibidores diferentes, verificar se o soro antiofídico produzido no Brasil é capaz de reconhecer a PDE através do ensaio ELISA indireto e, por fim, realizar ensaios de agregação plaquetária com esta enzima. Desta forma, o presente estudo torna-se relevante por avaliar uma toxina que é importante para o acidente ofídico, mas até o momento pouco estudada, ampliando consideravelmente o conhecimento sobre esta classe enzimática. (AU)