A manutenção e a maturação de uma linhagem celular de oligodendrócitos

Resumo

Várias investigações realizadas no projeto principal envolverão células MO3.13. As células MO3.13 expressam as características fenotípicos de oligodendrócitos primários, além dos marcadores de superfície como galactocerebrosidase (GalC) e myelin-associated glycoprotein (MAG). Neste contexto, a caracterização da expressão proteica é um aspecto importante, quando se considera usar MO3.13 como modelo para investigar desordens associadas ao cérebro e o sistema nervoso central, no entanto não é incluída nas caracterizações já estabelecidas. O bolsista manterá esta linhagem celular para futuras investigações e a preparará para as análises proteômicas. As células MO3.13 serão cultivadas em DMEM contendo 10% (v/v) soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 ¼g/mL) aos 37°C em 5% CO2. Os pellets de células MO3.13 serão homogeneizados em 50 µL de 7M ureia, 2M tioureia, 4% CHAPS, 2% ASB-14 e 70 mM DTT, usando um kit de homogeneização (GE Healthcare). Os lisados proteicos serão centrifugados por 10 min a 14 000 rpm, os sobrenadantes coletados e concentrações de proteína determinadas pelo ensaio Qubit. Cinquenta µg de cada amostra serão diluídos em tampão de amostra para SDS-PAGE, aquecidos por 5 min aos 95°C e separados usando mini-géis de SDS-PAGE 12%. As proteínas serão visualizadas pelo corante Coomassie brilliant blue e cortados. Cada fatia será então sujeitada à digestão in gel, e os peptídeos resultantes serão armazenados aos -20°C antes das análises de espectrometria de massas. Para a maturação destas células, se usará o protocolo estabelecido neste laboratório (Seabra G et al. Methods Mol Biol. 2019; 1916:113-121).