Estudo da regulação da ADAM17 recombinante pela determinação dos sítios de fosforilação do domínio citoplasmático e de seus ligantes em células normais e de câncer.

Resumo

As ADAMs (metaloproteinases de mamíferos compostas dos domínios metaloproteinase, tipo-disintegrina e rico em cisteínas, tipo fator de crescimento epidermal, domínio transmembrana e citoplasmático) apresentam-se com expressão aumentada em tumores malignos, como o carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, que é considerado o quinto mais comum no mundo. Considerando as vias que essas proteases podem modular, essas proteases estão muito associadas à tumorigênese e progressão de tumor. Têm sido apontadas como reguladoras chaves dos mecanismos de sinalização celular, pois são responsáveis pela liberação de ectodomínios de proteínas de superfície celular mediando a transdução de sinal entre GPCR e EGFR. Está claro que existe essa via tripla de ativação e que as ADAMs funcionam como efetores da sinalização mediada pela GPCR. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos de ativação das ADAMs via domínio citoplasmático e as vias que essas proteases podem regular. Dessa forma, esse projeto se propõe a estudar os mecanismos de ativação das ADAMs via fosforilação do domínio citoplasmático e o seu papel na regulação das vias de sinalização em queratinócitos normais e cancerosos (carcinoma oral de células escamosas). Com essa finalidade, será realizada transfecção e super-expressão de ADAM17 recombinante em células normais e cancerosas. Para determinação dos sítios de fosforilação no domínio citoplasmático, a ADAM17 recombinante será recuperada por imunoprecipitação com anticorpo anti-FLAG e as proteínas que se ligarem às ADAMs serão eluídas com peptídeo FLAG. A determinação dos sítios de fosforilação e a identificação dos ligantes do domínio citoplasmático serão realizadas por espectrometria de massas e a validação dos alvos da ADAM17 será realizada por western blot. Além disso, ensaios de viabilidade, migração e invasão para comparação do efeito da super-expressão da ADAM recombinante no comportamento das células também serão realizados. O conhecimento dos ligantes e das vias de sinalização e regulação das ADAMs podem elucidar alvos atrativos para o desenho de drogas que modulem a ação dos seus ligantes.