Pegilação N-terminal de proteínas e purificação por sistemas aquosos bifásicos

Resumo

Os medicamentos biológicos representam um grande avanço realizado pela indústria farmacêutica, que gerou receitas consideráveis para as companhias detentoras das patentes das moléculas inovadoras inseridas recentemente no mercado. Entretanto, a necessidade econômica de permanecer competitivo no mercado e de solucionar os problemas intrínsecos de biofármacos proteicos como imunogenicidade e instabilidade biológica levou ao aprimoramento de fármacos biotecnológicos existentes, surgindo então os biobetters. Nesse contexto, uma das técnicas mais empregadas atualmente para obtenção de biofármacos, incluindo biobetters, consiste na ligação covalente de cadeias de poli(etileno glicol) (PEG). Essa técnica, também conhecida como peguilação, permite o aprimoramento tanto farmacocinético quanto farmacodinâmico de biofármacos, em especial aqueles de natureza proteica. Nesse projeto, pretendemos estudar a peguliação sítio específica N-terminal de diversas proteínas (BSA, catalase, L-asparaginase e lisozima), bem como a utilização de sistemas de duas fases aquosas para purificação das proteínas peguiladas das moléculas de proteína que não reagirem. Inicialmente, será estudada a reação com a proteína BSA, de maneira a definir as melhores condições de monopeguilação. Será estudada a influência da força iônica variando-se a molaridade do tampão PBS (0,01, 0,1 ou 0,2 M), a influência da proporção PEG:Proteína (25:1 ou 50:1) e a influência do pH (6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0) no rendimento da reação e estabilidade proteica. Definidas as condições acima, investigaremos o tempo reacional que forneça a menor taxa de polidispersão (por ligação do PEG em sítios inespecíficos). Em seguida, as proteínas peguiladas serão purificadas por cromatografia de troca iônica e exclusão molecular. A partição das proteínas monopeguiladas em sistemas de duas fases aquosas PEG/fosfato de potássio será investigada, empregando-se PEG de diferentes massas moleculares e diferentes composições de tampão fosfato de potássio. Será investigada também a possibilidade de se utilizar a própria proteína peguilada como agente polimérico formador de fase em sistema PEG-proteína/fosfato de potássio. As melhores condições obtidas serão testadas com o meio reacional contendo a proteína peguilada, sem purificação prévia. Para as proteínas que forem enzimas (catalase, L-asparaginase e lisozima), estudaremos também a termodinâmica de desnaturação térmica da enzima peguilada em comparação com a forma não peguilada, assim como a termodinâmica da reação catalisada para as formas peguilada e não peguilada. (AU)