Edição genética em larga escala para o estudo de doenças do neurodesenvolvimento em modelos celulares isogênicos

Resumo

A base genética das doenças do neurodesenvolvimento (NDD) inclui mutações raras de alta penetrância e variantes comuns de efeito menor. Variantes genéticas raras de novo, tanto de perda de função (LoF) quanto de sentido trocado em genes evolutivamente conservados, constituem os fatores de risco mais conhecidos associados a NDD. O grupo de genes comumente afetados por essas variantes se encontra enriquecido em duas vias principais: (1) comunicação neuronal e (2) regulação da expressão gênica, ou seja, genes que codificam reguladores da cromatina e fatores de transcrição. Análises funcionais sugerem que essas duas vias estão conectadas durante o neurodesenvolvimento, apesar de seus mecanismos de convergência ainda não terem sido elucidados. Além disso, pouco se conhece sobre o impacto das variantes de sentido trocado em comparação a variantes LoF. Nesta proposta, vamos estabelecer uma plataforma de engenharia genômica de larga escala baseadas em CRISPR que permite edições simultâneas no genoma. Aplicaremos essa plataforma de edição genômica em linhagens humanas de células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) para a introdução de variantes LoF e de sentido trocado em genes associados a NDD pertencentes a vias de regulação transcricional. Estes modelos celulares isogênicos, gerados em hiPSC, serão diferenciados em células tronco neurais e neurônios glutamatérgicos corticais, com o intuito de interrogar as consequências moleculares dessas perturbações genéticas. Será explorada a desregulação direta ou indireta de genes críticos para neurogênese e função neuronal decorrente da LoF dos genes alvos relacionados com a regulação da transcrição (Objetivo 1). Em seguida, o impacto dessas edições de LoF será comparado com o impacto de variantes de sentido trocado observadas em pacientes com NDD (Objetivo 2). As linhagens neuronais derivadas de hiPSCs carregando edições genômicas terão o seu transcriptoma e o seu perfil de acessibilidade de cromatina delineado por meio de RNA-seq e por Ensaio para Cromatina Acessível por Transposase (ATAC)-seq, com o objetivo de definir as consequências moleculares derivadas da introdução dessas variantes genéticas. Este estudo irá, portanto, implementar novas tecnologias, gerar modelos neuronais e integrar datasets para identificar os pontos de convergência em assinaturas moleculares causadas por NDD, que em estudos futuros poderão constituir alvos de manipulações farmacológicas. (AU)