Evaluation, design and standardization of primers for Candida albicans virulence genes and their expression in clinical isolates submitted to antifungal therapies

Author(s)

Gabriela Caroline Alonso

• Document type: Master's Dissertation
• Press: Araraquara. 2018-03-07.
• Institution: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Faculdade de Odontologia. Araraquara
• Defense date: 2017-07-07
• Advisor: Ana Cláudia Pavarina; Marlise Inês Klein

Abstract

Este estudo avaliou longitudinalmente a expressão de genes de virulência de isolados clínicos de Candida albicans de pacientes com candidose oral tratados com Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) ou Nistatina (NIS). Inicialmente, a especificidade de primers da literatura e novos primers desenhados para os genes de virulência de C. albicans ALS1, CAP1, CAT1, EFG1, HWP1, LIP3, PLB1, SAP1, SAP4, SOD1, SOD5 e ACT1 (gene de controle) foi avaliada através de análises in silico e in vitro. Para a análise in silico, foi realizada uma busca no Pubmed por artigos com sequências de primers que avaliaram a expressão gênica de C. albicans. Em seguida, a homologia dos primers foi analisada (BLAST e ClustalW2) assim como a presença de estruturas secundárias (Mfold). Novos primers foram desenhados (Beacon Designer™) a partir de sequências obtidas do "Candida Genome Database". Os primers foram sintetizados e testados in vitro pela técnica de PCR utilizando um painel de DNA genômico de diferentes espécies de Candida, com seus produtos visualizados em gel de agarose. Reações de qPCR foram realizadas para determinar a concentração ótima e a eficiência dos primers. Para a análise da expressão gênica, os pacientes foram submetidos à aPDT [6 sessões com aplicações do fotossensibilizador Photoditazine™ (200 mg/mL) no palato e na prótese por 20 minutos com posterior aplicação de luz LED (660 nm – 50 J/cm²)] ou submetidos ao tratamento convencional [bochechos de um minuto com 1 mL da solução de Nistatina (100.000 UI/mL) quatro vezes ao dia durante 15 dias]. Coletas microbiológicas foram realizadas nos tempos Inicial (sem tratamento), Final (pós-tratamento) e 60 dias após o início do tratamento. As amostras foram plaqueadas em meio CHROMagar e as colônias (C. albicans) foram submetidas à extração e purificação do RNA. O cDNA foi sintetizado e a técnica de RT-qPCR realizada. Os dados da expressão foram analisados por Análise de Variância para Medidas Repetidas Mista (α = 0,05). Os primers da literatura para os genes SAP1 e HWP1 foram específicos para C. albicans enquanto o gene SOD1 reagiu com C. albicans e Candida dubliniensis. Os primers delineados para os genes ACT1, ALS1 e HWP1 foram detectados apenas em C. albicans, enquanto os primers para os genes CAP1, CAT1, EFG1, LIP3 e PLB1 foram detectados em C. albicans e C. dubliniensis. Todos os primers apresentaram Melt Curves ideais, coeficiente de correlação ≅1 e eficiência entre 90-110%, com slope ≅-3.3. Os dados mostraram que a expressão gênica do gene CAT1 foi superior na coleta final em relação à coleta inicial para ambos os grupos (p = 0,041). A expressão do gene LIP3 foi reduzida significativamente da coleta inicial para a final, independente do tratamento (p = 0,039). O gene SOD1 teve sua expressão diminuída entre as coletas, independente do tratamento (p = 0,021). A expressão dos genes PLB1 e ACT1 foi maior no grupo aPDT, independente das coletas (p < 0,01 e p = 0,046, respectivamente). Para os genes ALS1, CAP1, EFG1, HWP1 e SAP1 não houve diferença estatística entre as coletas independente do tratamento, os quais não influenciaram a expressão de tais genes (p > 0,05). Portanto, os dados mostram que os primers estão padronizados para análises de expressão gênica a partir de amostras clínicas e não ocorreram diferenças significativas na expressão dos genes de virulência de isolados clínicos de C. albicans de pacientes tratados com aPDT quando comparados com os tratados com NIS, exceto para os genes PLB1 e ACT1. (AU)

• FAPESP's process: 15/13409-0 - Virulence gene expression of clinical isolates of Candida albicans treated with Antimicrobial Photodynamic Therapy
• Grantee: Gabriela Caroline Alonso
• Support type: Scholarships in Brazil - Master