Estudo do comportamento cinético das convertases

Resumo

As proteino-convertases (PCs) são enzimas proteolíticas que pertencem à família das serino-proteases semelhantes à subtilisina. Essas enzimas são encontradas em células eucarióticas na rota secretória, em vesículas secretórias do trans-Golgi que estão envolvidas no processamento de pró-proteínas, pró-hormônios, pró-receptores e proteínas do capsídios virais. São endopeptidases dependentes de Ca2+ que reconhecem e clivam sequências básicas Lys-Arg ou Arg-Arg presentes no domínio C-terminal de seus substratos proteicos e essas enzimas estão envolvidas em vários processos fisiopatológicos, tais como: processamento dos fatores de crescimento tecidual TGF-² e BMP-4, do pró-receptor da insulina, da glicoproteína gp160 do vírus do HIV, da glicoproteína do vírus Ebola e do antígeno protetivo antrax. A família das PCs de mamíferos compreende sete membros, a furina, PACE4, PC4, PC5/6, PC7, PC1 e PC2. A convertase Kex2 é tida como o arquétipo das PCs e foi primeiramente identificada em Saccharomyces cerevisiae. Neste projeto objetivamos estudar a especificidade das convertases Kex2, PC1 e Furina sobre a hidrólise de substratos peptídicos fluorescentes do tipo FRET, bem como, determinar as constantes de velocidades individuais de cada passo catalítico das convertases, ou seja, a determinação do passo de ligação do substrato (constante de associação k1 e dissociação k-1) e da catálise do substrato (constante de acilação k2 e hidrólise k3) por técnicas de monitoração da hidrólise de substratos fluorescentes, por "stopped-flow" e pelo efeito da temperatura nas diferentes constantes de velocidade da reação enzimática. Também, será estudado o efeito de moduladores alostéricos sobre a atividade das convertases, tais como: a ligação de metais mono- e divalentes às enzimas e o efeito da interação com glicosaminoglicanos. O efeito da modulação alostérica dos ligantes também será avaliado pela alteração conformacional das enzimas por florescência intrínseca e por espectroscopia de dicroísmo circular. Assim, o conjunto de informações derivados dos estudos de especificidade, análise termodinâmica, atuação de moduladores permitirá o melhor entendimento do comportamento cinético dessas enzimas proteolíticas. (AU)