Modulação artificial da diferenciação neuronal e função de receptores por oligonucleotídeos sintéticos atuantes aos níveis gênico e protéico

Resumo

A linhagem P19 derivada de teratocarcinoma murino será utilizada como modelo de diferenciação neuronal in vitro. Mediante tratamento com agentes químicos em protocolos bem estabelecidos, tais células expressam (com cinéticas definidas) uma variedade de marcadores moleculares de diferenciação neuronal e comportam-se como neurônios em ensaios de eletrofisiologia. Estaremos particularmente interessados em caracterizar o mecanismo de ação de receptores purinérgicos de tipo P2X e P2Y recentemente implicados no desenvolvimento neuronal e funcionamento normal do sistema nervoso. Técnicas de eletrofisiologia de cinética rápida serão utilizadas para determinarmos os passos de velocidade envolvidos na ativação dos receptores em presença de agonistas inertes ativáveis, e o uso de inibidores genéricos nos permitirá caracterizar os sítios regulatórios constituintes dos diferentes subtipos de receptor purinérgico. Tais informações nos permitirão estabelecer protocolos para seleção de aptâmeros de RNA a partir de bibliotecas combinatórias capazes de estabilizar formas ativadas e inibidas dos receptores. Além disso, o potencial da técnica de interferência de RNA (RNAi) como forma de silenciar especificamente os genes de receptores purinérgicos será testado nessa linhagem, e caso o mecanismo de degradação de mensageiros, conservado em uma série de sistemas, esteja presente nas células P19, tal estratégia será usada para produzir knock-outs funcionais dos receptores purinérgicos. Em um segundo momento, aptâmeros selecionados capazes de interferir com a atividade de receptores ao nível proteico e RNAs dupla-fita capazes de interferir ao nível gênico serão ministrados a células em cultura em diferentes tempos do processo de diferenciação neuronal. De tal forma, poderemos avaliar o papel dos receptores purinérgicos em tal processo. O caráter embrionário de células P19 garante que as mesmas possam seguir diferentes destinos fenotípicos mediante tratamento experimental adequado, podendo assim ser diferenciadas em células musculares lisas e esqueléticas, além de neurônios e células gliais. Estudos sobre o estabelecimento de programas específicos de transcrição em modelos de transição fenotípica (diferenciação, transformação, senescência) utilizando células de eucariotos superiores em cultura não são muito comuns. As células P19 constituem um modelo particularmente interessante para o estudo de controles epigenéticos associados à diferenciação celular, pois os diferentes estágios fenotípicos -i.e. células não diferenciadas, mioblastos e neurônios -podem ser comparados de forma sistemática quanto a múltiplos parâmetros. O presente projeto visa principalmente investigar alterações da organização da cromatina no núcleo celular associadas às diferentes transições fenotípicas. Para tanto, pretendemos examinar marcadores moleculares, como a acetilação de histonas e a metilação de determinados promotores gênicos; e marcadores estruturais, tais como a localização espacial de sequências intensamente transcritas, ou não, em núcleos interfásicos e os padrões espaço-temporais de replicação e transcrição nos diferentes estágios de diferenciação. (AU)