Análise da participação da produção endógena de ácidos graxos nos mecanismos de apoptose, metástase e vasculogênese em melanoma

Resumo

Ácido graxo sintase (FASN) é a enzima responsável pela síntese endógeno de ácidos graxos. Evidências experimentais e clínico-patológicas indicam uma correlação entre produção/atividade de FASN e proliferação, apoptose, geração de metástases e pobre prognóstico em tumores humanos, incluindo o melanoma. Seu bloqueio causa inibição do ciclo celular e apoptose em células malignas, além de diminuir o crescimento de células endoteliais e vasos sanguíneos. O melanoma é a neoplasia de pele e mucosas de pior prognóstico devido ao seu alto índice metastático e baixa sensibilidade à radioterapia e quimioterapia. Recentemente demonstramos que a inibição de FASN reduz em 50% os Iinfonodos metastáticos em melanomas experimentais, diminui a proliferação e causa apoptose nas células B 16-F10. O presente projeto dará continuidade aos nossos estudos sobre o papel de FASN em melanomas e pretende verificar: 1) como a inibição de FASN interfere no ciclo celular, através da mensuração da Iipogênese, de apoptose e análise do ciclo celular e seus principais reguladores; 2) se há envolvimento mitocondrial na apoptose causado pelos inibidores de FASN Orlistat ou cerulenina (dependente de transição de permeabilidade mitocondrial e/ou de Bax) e se existem diferenças nas vias apoptóticas ativadas por estas drogas, através da liberação de citocromo c, avaliação do potencial elétrico de membrana mitocondrial, ativação de caspase-3, produção de EROs e medida de Ca2+ citosólico; 3) os índices de apoptose induzidos pelo bloqueio de FASN em culturas primárias de meia no ma; 4) o papel de FASN na proliferação de células endoteliais sangüíneas e linfáticas; 5) se HIF1 a atua na regulação da expressão de FASN em melanomas experimentais, por meio de Q-RT-PCR, western blotting e ensaios proteolíticos in vitro; 6) o efeito do Orlistat na angiogênese por meio de implantes intradérmicos de células B 16-F1 O em camundongos C57BL6 e análise da densidade vascular peritumoral; 7) a produção de FASN, VEGFR -2/-3, VEGF A/C, bem como de HIF1 a em melanomas experimentais tratados ou não com inibidores de FASN, através de western blotting, Q-RT-PCR e imunohistoquímica; 8) o efeito da inibição de FASN na linfangiogênese através de microlinfangiografia fluorescente; 9) o efeito da inibição de FASN na colonização pulmonar por células B 16-Fl O; 10) os efeitos do Orlistat e da cerulenina sobre o expressão de integrinas e expressão/atividade de MMPs em células de melanoma, através de reações de western blotting e imunofluorescência, zimografia e siRNA; 11) a expressão de MMPs e integrinas em tumores primários abdominais e suas metástases no mediastino, através de western blotting e zimografia; 12) o papel de FASN na interação entre células de melanoma e proteínas da matriz extracelular, através de ensaios de adesão in vitro. (AU)