Investigação dos determinantes moleculares envolvidos na interação com os substratos de Tsa1 e Tsa2 de Saccharomyces cerevisiae

• Processo: 11/13500-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2011
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2015
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Marcos Antonio de Oliveira
• Beneficiário: Carlos Alexandre Breyer
• Instituição Sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
• Assunto(s): Estresse oxidativo Biologia estrutural Peroxirredoxinas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Estresse oxidativo | peroxirredoxinas | Biologia Molecular Estrutural

Resumo

Peroxirredoxinas (Prx) são proteínas antioxidantes capazes de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos e tem se destacado devido sua eficiência catalítica, alta abundância e distribuição nos diversos compartimentos celulares. As Prx são capazes de reduzir seus substratos utilizando um resíduo de cisteína altamente reativa localizada em seu sítio ativo, denominada de cisteína peroxidásica (CP-SH), a qual no processo de decomposição de peróxidos é oxidada a cisteína ácido sulfênico (CP-SOH). Em Saccharomyces cerevisiae, há duas isoformas citosólicas de Prx (Tsa1 e Tsa2), que possuem grande semelhança (86% de identidade e 96% de similaridade). Em adição à atividade peroxidásica, já foi demonstrado que as enzimas Tsa1 e Tsa2 possuem atividade de chaperona; entretanto, a concentração intracelular dessas proteínas varia significativamente. Enquanto Tsa1 apresenta ~378000 moléculas por célula, Tsa2 possui somente 4800 na fase log de crescimento. Desta forma, tem-se postulado que apesar da grande semelhança, Tsa1 estaria envolvida principalmente na defesa celular em reposta a insultos oxidativos ou térmicos, ao passo que Tsa2 teria um maior envolvimento na transdução de sinal, em eventos como crescimento e apoptose. Já foi demonstrado que ambas as enzimas podem ser reduzidas pelas tiorredoxinas citosólicas (Trx1 e Trx2). Assim como as Prx citosólicas, Trx1 e Trx2 compartilham elevada semelhança nas suas estruturas primárias (78% de identidade e 89% de similaridade) e muitas vezes são consideradas proteínas redundantes. Entretanto, nenhum estudo até o momento atentou para verificar se as taxas de redução Tsa1 e Tsa2 são equivalentes entre si quando se utiliza Trx1 ou Trx2. Recentemente foi determinada a estrutura de Tsa1 e a análise de sua estrutura revela que 27 dos 28 aminoácidos que a diferem de Tsa2 se encontram na superfície da molécula, o que sugere interações particulares com as Trx citosólicas. Este projeto tem como objetivos efetuar análises sistemáticas das relações moleculares de Tsa1 e Tsa2 com Trx1 e Trx2, o qual deve resultar em um maior entendimento nos processos de redução/superoxidação de Tsa1 e Tsa2 e, consequentemente, nos processos celulares em que estas proteínas participam. Para tanto, pretendemos determinar a estrutura de Tsa2 no estado reduzido e oxidado em dissulfeto visando o entendimento em detalhe de suas diferenças com Tsa1 e relações moleculares com seus substratos. Também será efetuada a avaliação comparativa das taxas de redução de Tsa1 e Tsa2 por Trx1 ou Trx2, por meio do ensaio de oxidação do NADPH. As taxas de redução influenciam decisivamente na superoxidação, oligomerização e função de chaperona de Tsa1 e Tsa2, estas serão avaliadas por meio de western blot (WB) utilizando anticorpos específicos para formas superoxidadas (in vitro e in vivo), cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS). Para maior aprofundamento na investigação, serão realizadas mutações sítio dirigidas individuais/combinatórias de aminoácidos de Tsa2 presentes na superfície de interação Tsa/Trx. As mutações substituirão aminoácidos em Tsa2 por seus correspondentes que ocupam a mesma posição em Tsa1 (Tsa2(S45T), Tsa2(K97N) e Tsa2(D150N).

Publicações científicas

(7)

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

DE MOURA, WERNER ALFINITO FEIO; SCHULTZ, LEONARDO; BREYER, CARLOS ALEXANDRE; DE OLIVEIRA, ANA LAURA PIRES; TAIRUM, CARLOS ABRUNHOSA; FERNANDES, GABRIELLA COSTA; TOYAMA, MARCOS HIKARI; PESSOA-JR, ADALBERTO; MONTEIRO, GISELE; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO. Functional and structural evaluation of the antileukaemic enzymel-asparaginase II expressed at low temperature by differentEscherichia colistrains. Biotechnology Letters, JUL 2020. (13/08617-7, 17/19942-7, 17/25272-4, 19/04054-4, 14/22039-9, 16/19245-1, 17/20291-0, 11/13500-6)

DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO; TAIRUM, CARLOS A.; SOARES NETTO, LUIS EDUARDO; PIRES DE OLIVEIRA, ANA LAURA; ALEIXO-SILVA, ROGERIO LUIS; MONTANHERO CABRERA, VITORIA ISABELA; BREYER, CARLOS A.; DOS SANTOS, MELINA CARDOSO. Relevance of peroxiredoxins in pathogenic microorganisms. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 105, n. 14-15, JUL 2021. (20/00845-4, 17/06263-4, 13/07937-8, 20/02868-1, 16/15849-0, 11/13500-6, 17/19942-7, 19/04054-4)

TAIRUM, CARLOS A.; SANTOS, MELINA CARDOSO; BREYER, CARLOS ALEXANDRE; PIRES DE OLIVEIRA, ANA LAURA; MONTANHERO CABRERA, VITORIA ISABELA; TOLEDO-SILVA, GUILHERME; MORI, GUSTAVO MARUYAMA; TOYAMA, MARCOS HIKARI; SOARES NETTO, LUIS EDUARDO; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO. Effects of Serine or Threonine in the Active Site of Typical 2-Cys Prx on Hyperoxidation Susceptibility and on Chaperone Activity. ANTIOXIDANTS, v. 10, n. 7, JUL 2021. (20/02868-1, 19/04054-4, 17/20291-0, 17/19942-7, 07/50930-3, 18/12628-8, 11/13500-6, 17/06263-4, 13/07937-8)

DE PAULA, CARLA PERES; DOS SANTOS, MELINA CARDOSO; TAIRUM, CARLOS A.; BREYER, CARLOS ALEXANDRE; TOLEDO-SILVA, GUILHERME; TOYAMA, MARCOS HIKARI; MORI, GUSTAVO MARUYAMA; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO. Glutaredoxin-like protein (GLP)-a novel bacteria sulfurtransferase that protects cells against cyanide and oxidative stresses. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 104, n. 12, APR 2020. (13/16192-6, 13/07937-8, 17/19942-7, 17/06263-4, 11/13500-6, 07/50930-3, 17/20291-0, 10/00172-8, 10/16827-3)

ROMANELLO, KAREN S.; TEIXEIRA, KARINA K. L.; SILVA, JOAO PEDRO M. O.; NAGAMATSU, SHEILA T.; BEZERRA, MARCOS ANDRE C.; DOMINGOS, IGOR F.; MARTINE, DIEGO A. P.; ARAUJO, ADERSON S.; LANARO, CAROLINA; BREYER, CARLOS A.; et al. Global analysis of erythroid cells redox status reveals the involvement of Prdx1 and Prdx2 in the severity of beta thalassemia. PLoS One, v. 13, n. 12, DEC 6 2018. (11/13500-6, 11/50358-3)

GUILHEN LONGO, LARISSA VALLE; BREYER, CARLOS ALEXANDRE; NOVAES, GABRIELA MACHADO; GEGEMBAUER, GREGORY; LEITAO JR, NATANAEL PINHEIRO; OCTAVIANO, CARLA ELIZABETE; TOYAMA, MARCOS HIKARI; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO; PUCCIA, ROSANA. The Human PathogenParacoccidioides brasiliensisHas a Unique 1-Cys Peroxiredoxin That Localizes Both Intracellularly and at the Cell Surface. FRONTIERS IN CELLULAR AND INFECTION MICROBIOLOGY, v. 10, AUG 4 2020. (13/07937-8, 17/19942-7, 06/05095-6, 13/25950-1, 07/50930-3, 17/20291-0, 11/13500-6)

DE MOURA, WERNER ALFINITO FEIO; SCHULTZ, LEONARDO; BREYER, CARLOS ALEXANDRE; DE OLIVEIRA, ANA LAURA PIRES; TAIRUM, CARLOS ABRUNHOSA; FERNANDES, GABRIELLA COSTA; TOYAMA, MARCOS HIKARI; PESSOA-JR, ADALBERTO; MONTEIRO, GISELE; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO. Functional and structural evaluation of the antileukaemic enzymel-asparaginase II expressed at low temperature by differentEscherichia colistrains. Biotechnology Letters, v. 42, n. 11, p. 12-pg., 2020-07-07. (13/08617-7, 11/13500-6, 16/19245-1, 17/25272-4, 19/04054-4, 17/19942-7, 14/22039-9, 17/20291-0)