Resumo
O grupo proponente tem estudado regularmente o reconhecimento de glicanos de células do hospedeiro por lectinas de patógenos e as respostas biológicas desencadeadas por tal reconhecimento. Lectinas de dois patógenos vêm sendo especialmente estudadas: 1) proteínas secretadas por micronemas do protozoário Toxoplasma gondii, TgMIC1 e TgMIC4, que reconhecem, respectivamente, glicanos que têm ácido siálico e beta-galactose como resíduos terminais; 2) proteína da superfície de leveduras de Paracoccidioides brasiliensis, denominada paracoccina, que reconhece N-acetilglucosamina. Em ambos os casos, as lectinas foram isoladas por cromatografia de afinidade em colunas de cada açúcar específico. Essas formas nativas foram parcialmente caracterizadas do ponto de vista estrutural e de propriedades biológicas. A relevância das atividades por elas desempenhadas levou-nos a clonar o gene que codifica cada lectina e expressá-lo heterologamente. As proteínas recombinantes obtidas foram verificadas quanto à reprodutibilidade das propriedades das lectinas nativas. Estudos funcionais revelaram que tais lectinas, tanto derivadas de T. gondii como de P. brasiliensis, exercem papéis relevantes na biologia do patógeno, bem como efeitos importantes sobre células da imunidade do hospedeiro. O reconhecimento envolvido na indução desses efeitos, a identificação das moléculas que contem os alvos do reconhecimento, a sinalização celular por ele desencadeada, as respostas celulares de ativação celular e produção de mediadores imunológicos dele decorrentes, bem como as consequências desses processos no que diz respeito à possibilidade de conferir resistência. No que se refere às lectinas de T. gondii, temos como objetivo caracterizar a interação estabelecida com N-glicanas associadas com TLR4, a exemplo do que já foi feito para TLR2; resolver a estrutura das N-glicanas de TLRs identificadas como alvos de reconhecimento das lectinas de T. gondii e implicadas na ativação celular; proceder a modelagem molecular de glicanas de TLR2 e sua interação com TgMIC1; expressar TgMIC1 e TgMIC4 em Pichea pastoris, ao invés de Escherichia coli, com intuito de obter proteína recombinante, solúvel e livre de LPS. Tencionamos ainda investigar a ocorrência de interação das lectinas de micronema com glicanos associados a receptores Notch. No que se refere à lectina paracoccina, temos como objetivo determinar sua expressão em micélios e formas de transição micélio-levedura de P. brasiliensis, comparando-a com a expressão em leveduras; caracterizar a interação da paracoccina com receptores de células da imunidade inata, com destaque para TLR2, abordando a exigência de heterodimerização do receptor e a participação de proteínas acessórias; determinar a dependência de reconhecimento de carboidratos para a ocorrência da interação de paracoccina com TLR2 e, em caso positivo; identificar a(s) N-glicana(s) do ectodomínio do receptor é (são) alvo(s) desse reconhecimento; investigar a modulação por paracoccina da expressão desses receptores em células da imunidade inata, bem como da produção de citocinas pelas mesmas células; determinar o efeito da administração de paracoccina em camundongos, quanto ao padrão de citocinas produzidas e a expressão de PRRs em fagócitos; caracterizar o efeito de N-glicanas sobre a atividade glucanase e amilase de leveduras de P. brasiliensis, bem como analisar sistematizadamente o efeito de AMPc na expressão enzimática de N-acetilglicosaminidase; determinar o papel de N-glicanos na atividade de enzimas de P. brasiliensis, e identificar proteínas que são N-glicosiladas, por eletroforese em gel diferencial (DIGE - Difference gel electrophoresis).Essas metas serão cumpridas pelo grupo local em colaboração com grupos de pesquisa no exterior, coordenados pelos Professores Nicholas Gay (Universidade de Cambridge, UK), Igor de Almeida (Universidade do Texas em El Paso, USA), Stephen Mathews e Ten Feizi (Imperial College, Londres, UK). (AU)
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